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酶作为一种绿色高效的生物催化剂,已经被广泛的应用于许多领域。但由于游离的酶稳定性相对较差,难以重复利用等原因,常常限制了其应用,常规的解决方案就是将其固定化。而传统的固定化方法虽然能在一定程度上解决酶在应用中遇到的部分问题,但仍存在诸多不足。本论文旨在探讨一种新型的酶固定化方法,为酶的应用奠定良好的基础。本课题是以荧光假单胞菌脂肪酶为模型酶,在基于油包水的乳液体系下对其进行无载体自交联固定化。旨在制备出具有较高酶活性,稳定性好,可以重复使用的固定化脂肪酶颗粒。主要探讨了油包水乳液体系的构建以及稳定性,优化了脂肪酶固定化工艺条件,并对固定化脂肪酶的酶学性质以及其外观形态及结构等进行了研究。结果如下:1.首先构建了相对稳定的油包水乳液体系,以复配(HLB=7)的表面活性剂作为乳化剂,添加比例为水相的25%(v/v)。乳液体系的油水比例为25:1,乳化方式为先超声乳化5 min,再磁力搅拌乳化5 min。通过Zeta电位粒度仪测得乳液体系的粒径范围在15μm~40μm之间,且其平均粒径为26.0μm。2.通过单因素实验和响应面实验对脂肪酶固定化工艺进行了优化。确定了最优的制备固定化脂肪酶的条件:以大豆油作为乳化体系油相,脂肪酶浓度为25.0 mg/mL,固定化温度为7℃,时间为1.8 h,保护剂添加量为水相的25%(v/v),交联剂添加量为水相的11%(v/v)。并在此条件下制备出固定化脂肪酶并测得其脂肪酶水解活力为9333U/mg。比优化前提高了13.4%。3.通过对固定化脂肪酶酶学性质的研究,发现其最适催化温度为45℃,比游离酶提高了5℃。最适催化pH为6.0,并且固定化脂肪酶的热稳定性和pH稳定性都有一定的增强。常见金属离子对它的激活作用明显增强,抑制作用均有减弱的趋势。经过35天的低温储存后仍然保留初始活力的约96%,经过11次的循环使用后,其脂肪酶水解活力仍保留最初活力的约78%,还测得脂肪酶的平均固定化率在91%左右,酶活平均回收率约为70%。经过对游离脂肪酶和固定化脂肪酶的催化动力学参数比较后发现固定化后的脂肪酶与底物的亲和能力变小,但固定化酶的最大反应速度增加了约2倍。4.通过利用荧光显微镜,傅里叶红外光谱仪,场发射扫描电子显微镜等仪器对固定化脂肪酶的外观形态及其结构进行研究。发现处于缓冲液中的固定化酶颗粒比较分散,粒径也比较均匀。脂肪酶固定化后酰胺I带中无规则卷曲的比例变化不大,β-折叠减少了1.1%,α-螺旋的比例增加量3.8%,β-转角却减少了2.5%。冻干后固定化脂肪酶呈现出形状不规则的片状结构,粒径大部分在30μm左右。