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细胞凋亡是生物正常的生理现象之一,它与生物生长发育以及环境胁迫的反应具有密切的关系。细胞凋亡过程受到一系列促细胞凋亡基因和细胞凋亡抑制基因的调控。至今,已克隆了许多相关基因并研究其功能,如Bax基因的过量表达能诱导细胞凋亡的发生,Bcl-2家族的基因在凋亡过程中起举足轻重的作用。但细胞凋亡的分子机理仍不清楚。为了更深入地了解调控细胞凋亡的基因以及分子机理,本研究利用酵母双杂交技术在人胎脑cDNA文库中筛选具有抗Bax诱导的细胞凋亡功能的基因,并初步研究其抗凋亡的作用机理。1.成功构建了表达载体pJG45-PpBI-1和pGilda-Bax质粒,用于研究来自竹子的抗凋亡抑制基因PpBI-1的功能及其作为人胎脑cDNA文库中抗细胞凋亡基因筛选的对照。2.基于Bax基因的促凋亡功能的原理,利用酵母双杂交技术,获得了26个能在诱导培养基上正常生长的阳性菌株。通过对这些阳性菌株提取总DNA,用Bax基因引物BaxP1/BaxP2进行PCR验证。结果表明,在26个菌株中,有24个能扩增出Bax基因(占92.3%),表明阳性菌株的抗性并不是由于Bax基因的丢失造成的,而是可能从人胎脑cDNA文库中筛选到了与Bax基因互作的抑制子。3.通过对筛选的阳性菌株的生长鉴定,表明各个菌株可能带有来自人胎脑cDNA文库的对Bax具有抑制功能的基因片段,从而表现出强弱不同的抗性。通过对其中11个筛选得到的文库cDNA片段进行PCR、测序、NCBI中BLAST分析,显示分别为人基因组的不同基因片段。4.为了验证cDNA文库基因片段的作用机理,通过连续多代培养和PCR验证的方法,获得丢失了文库cDNA基因片段但仍携带Bax基因的质粒菌株,然后对其进行敏感性试验,结果表明,选用的5个菌株在文库质粒丢失后,仍然表现出很强的抗性,对其可能的原因作了初步分析。5.将文库筛选得到的基因片段(B6、A10、A19)电转化大肠杆菌JM109,筛选转化子,进行生长试验。结果表明,含这3个cDNA文库基因片段的质粒转化后,均能在筛选培养基上长出转化菌株。初步分析了这些基因片段的作用机理。但对这些基因的编码蛋白及其抗细胞凋亡的机制还需进一步的验证。