论文部分内容阅读
番茄是我国北方地区广泛种植的蔬菜作物。作为一种喜温蔬菜,番茄在冬春季节极易受低温伤害,从而影响产量与品质,造成巨大的经济损失。低温胁迫分为冷害(0-10℃)和冻害(0℃以下)。番茄遭受冷害时会积累大量活性氧,造成膜脂过氧化,并且冷害还会对番茄的光合机构和光合作用造成严重的影响,导致其生长发育迟缓、座果率下降、畸形果数量增加,严重时会导致植株死亡。花青素是一种天然的水溶性色素,因其具有抗氧化能力,所以在一定程度上能缓解低温对番茄的伤害。花青素的合成受到多个基因的调控和多种环境因素的影响,调控花青素合成的转录因子主要包括MYB、bHLH、WD40等家族。MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一,在不同植物中参与多种生理生化过程的调节,并且MYB转录因子家族还参与植物对低温等逆境胁迫的响应。番茄基因组中共有127个MYB转录因子,目前关于它们功能的报道还较少。本实验从番茄中分离得到了一个MYB转录因子基因(SlMYB113),以过表达SlMYB113的转基因番茄与野生型植株为实验材料,研究了该基因对番茄低温抗性及低温胁迫下花青素合成过程的影响。该研究结果对于阐明MYB转录因子在番茄低温抗性中的功能具有重要意义。主要研究结果如下:(1)根据SGN网站(https://solgenomics.net/)上已知的SlMYB113的基因序列设计引物,以番茄的cDNA为模板,通过PCR反应获得SlMYB113基因的全长。SlMYB113基因全长950 bp,开放阅读框780 bp,编码259个氨基酸。氨基酸同源比对和进化树分析发现SlMYB113属于R2R3型的MYB转录因子。(2)构建SlMYB113-GFP载体和SlMYB113-FLAG载体,分别转化农杆菌菌株GV3101和LBA4404,将含有SlMYB113-GFP质粒的GV3101和含有SlMYB113-FLAG质粒的LBA4404分别瞬时转化烟草和在番茄中稳定表达,然后分别通过激光共聚焦显微镜观察和Western-blot分析SlMYB113蛋白的亚细胞定位,结果表明该蛋白定位于细胞核。(3)通过qRT-PCR分析了SlMYB113在不同胁迫下的表达模式,发现SlMYB113受低温、干旱等胁迫和赤霉素等信号分子的诱导表达。组织表达分析结果表明SlMYB113在叶片中的表达量最高。(4)构建pBI121-SlMYB113的过表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,获得过表达SlMYB113的转基因番茄植株,对转基因株系进行筛选鉴定并选取表达量高的OE-8、OE-11和OE-22株系进行后续的实验。(5)与野生型相比,在正常条件和低温处理下,过表达SlMYB113的转基因番茄叶片中花青素的积累显著增加,使叶片背面呈现明显的紫色。而且一些花青素合成相关的基因在转基因番茄中的表达被明显上调,这说明SlMYB113参与了番茄花青素合成过程的调控。(6)低温胁迫下,转基因SlMYB113番茄和野生型的MDA积累量和REC都上升,转基因番茄的增加量低于野生型,这说明在低温胁迫下转基因番茄的细胞膜受损程度低,低温耐受力高。在低温胁迫下,转基因番茄的活性氧积累量比野生型低,但是转基因番茄中的抗氧化酶活性比野生型弱,这说明转基因番茄中的活性氧可能被花青素清除。(7)通过酵母单杂交实验和转录激活实验证明了SlWHY1能与SlMYB113互作,SlWHY1能结合在SlMYB113基因的启动子上,并且能促进SlMYB113的表达。这说明SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。实验结论:我们从番茄中分离得到了一个R2R3类型的MYB转录因子SlMYB113。该基因全长980 bp,开放阅读框全长780 bp,编码259个氨基酸。该基因的产物定位于细胞核;SlMYB113的表达受低温、干旱和赤霉素等多种胁迫和激素诱导,且在叶片中表达量最高;过表达SlMYB113增加花青素的积累,从而提高了转基因番茄的低温抗性;SlMYB113是SlWHY1的下游靶基因。