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研究背景：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的,目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。Mtb寄生在巨噬细胞内，主要引起细胞介导的免疫应答。γδT细胞是与αβT细胞在许多方面有不同特征的独特的一类T细胞，在抗结核感染免疫中可能发挥重要作用。已知γδT细胞可通过释放细胞因子如IFN-γ激活巨噬细胞对Μtb的吞噬杀伤活性，还发现γδT细胞还可直接杀伤被Mtb感染的巨噬细胞，这在γδT细胞参与抗结核感染的免疫保护作用中可能有重要意义，但有关人γδT细胞杀伤Mtb感染巨噬细胞的具体机理有待进一步探讨。 目的：建立流式细胞术检测单核巨噬细胞吞噬荧光素标记Mtb的方法；建立Mtb感染巨噬细胞模型；流式细胞术检测人γδT细胞对Mtb感染的巨噬细胞的细胞毒活性；观察IL-15对人γδT细胞杀伤Mtb感染巨噬细胞的影响。 方法：用苏通氏液体培养基培养Mtb H37Ra，制备Mtb菌悬液，用不同浓度荧光素(FITC)标记Mtb，流式细胞术检测FITC对Mtb的标记率。FITC标记的Mtb与人外周血单核细胞和佛波醇酯(PMA)激活分化的THP-1细胞(巨噬细胞)，共孵育不同时间后，或FITC标记的Mtb与巨噬细胞以不同比例共孵育1 h或2 h后，用流式细胞术检测 FITC阳性的单核细胞和巨噬细胞的数值，计算对 Mtb的吞噬率；Mtb以10∶1的比例感染巨噬细胞18 h，以流式细胞术、抗酸染色和激光共聚焦显微镜来观察感染模型的建立。流式细胞术检测PMA分化前后和Mtb感染后THP-1细胞表面CD14表达的变化。用Mtb-Ag刺激培养人外周血单个核细胞(PBMC)，优势扩增γδT细胞，流式细胞仪检测Mtb抗原活化的T细胞?(MtbAT)中的γδT细胞百分率，大于85％时，作为效应细胞用于γδT细胞对Mtb感染巨噬细胞的细胞毒活性实验。用不同浓度羧基荧光素二醋酸盐酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记 Mtb感染的巨噬细胞，作为靶细胞。将效应细胞与靶细胞以不同比例共孵育4 h，用碘化丙啶(PI)染色后用流式细胞仪检测检测CSFE和PI双阳性细胞为杀伤的靶细胞，计算γδT细胞对Mtb感染巨细胞的细胞毒活性；并检测IL-15作用γδT细胞24 h后，γδT细胞对Mtb感染巨噬细胞的细胞毒活性的影响。 结果： 1. FITC(50μg/ml)与Mtb作用2 h时对Mtb的标记率达92%。人单核细胞对FITC标记Mtb的吞噬率从孵育时间10 min时的35%增加至120 min的80%。巨噬细胞对FITC-Mtb的吞噬率从1 h的30%增加至6 h的81%。未加台盼蓝淬灭时，单核细胞在10 min和120 min对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比，分别增加29%和6%；巨噬细胞在1 h和6 h对FITC-Mtb的吞噬率与加台盼蓝淬灭相比分别增加1%和7%。 2.巨噬细胞与FITC-Mtb共孵育1 h时，巨噬细胞与Mtb比例从1∶1增加至1∶100，其吞噬率则从6.5%增加至85.1%，巨噬细胞与FITC-Mtb共孵育2 h时，巨噬细胞与Mtb比例从1∶1增加至1∶100，其吞噬率则从12.8%增加至89.9%。 3. THP-1细胞表达CD14的阳性率为4.5%，PMA作用后，CD14阳性率为22.3%，差异显著(P<0.01)。Mtb感染后，CD14阳性率增加至27.5%，差异显著(P<0.01)。 4.人γδT细胞与THP-1细胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后，γδT细胞对THP-1细胞的细胞毒活性从16.1%增加至47.2%，人γδT细胞与Mtb感染的巨噬细胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后，γδT细胞对Mtb感染的巨噬细胞的细胞毒活性从22.5%增加至80.7%。 5.人γδT细胞与IL-15共孵育24 h后与Mtb感染的巨噬细胞以10∶1的比例作用4 h，γδT细胞对Mtb感染的巨噬细胞的细胞毒活性为64.1%，高于无IL-15刺激的46.8%，差异有显著性(P<0.05)。 结论： 1.流式细胞术可用于检测人外周血单核细胞和激活的巨噬细胞系（ΤΗP?1)对FITC标记Mtb的吞噬率，可反映吞噬率与单核巨噬细胞与Mtb作用时间和比例有相关性，流式细胞术是测定单核巨噬细胞对Mtb吞噬活性的好方法。 2. PMA作用后的THP-1细胞，表达CD14的THP-1细胞的阳性率升高；Mtb可以诱导THP-1细胞表达CD14增加。 3.人γδT细胞对Mtb感染巨噬细胞的杀伤活性明显高于对未感染Mtb巨噬细胞的作用，且杀伤活性随效靶比的增加而增加。 4. IL-15可以增强人γδT细胞对Mtb感染巨噬细胞的细胞毒活性。