Bt PP61 cry1Ib2基因的克隆表达及其表达的蛋白对柑橘凤蝶的生物活性研究

• 作 者: 关夏玉
• 机 构: 福建农林大学
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2008年01期
• 关键词: 苏云金芽孢杆菌 crylIb2基因 克隆 表达 生物测定 柑橘凤蝶

本研究以从鱼尾葵（Cargota mitis Lour）上分离的PP61菌株上寻找新的cry基因表达的Cry蛋白对柑橘凤蝶有效活性为目的,对Bt PP61菌株进行一系列的生理生化分析,推测PP61可能属库斯塔克亚种。采用PCR-RFLP技术对PP61菌株所含cry基因进行分析,含有编码ICP的cry1Ba、cry1Cb、cry1Ib和cry2Ab等基因。自1995年Shin等克隆cry1Ib1基因后,并未有后续研究报道。因此,本研究从Bt PP61中克隆得到的cry1Ib基因全长2160 bp,编码719Aa的蛋白,该蛋白分子量和等电点通过软件预测分别为81.39 kDa和6.425。cry1Ib已在GenBank上登录,登录号为EU233027,并被Btδ—内毒素国际基因命名委员会正式命名为cry1Ib2。在线BLAST软件分析表明推导的Cry1Ib2与已报道的Cry1I蛋白具有很高的氨基酸序列同源性。信号肽分析说明Cry1Ib蛋白的前端没有信号肽,它是一种胞内蛋白。用在线Conserved Domain Search工具进行保守功能区分析,推导出Cry1Ib2蛋白质一级结构功能域主要包含有:位于毒素分子N端的结构域Ⅰ、位于C端的结构域Ⅲ及位于结构域Ⅰ和结构域Ⅲ之间的结构域Ⅱ,其中N端结构域参与了细胞膜的穿孔与芽孢的形成,后两者则参与了与膜受体蛋白的识别和结合。对Cry1Ib2的二级和三级结构进行预测,结果显示在蛋白质二级结构中,25%为α-螺旋,28%为β-片层,18%为β-转角,29%为无规则线圈。此外,通过将cry1Ib2与pET29a（+）表达载体连接,构建了重组表达载体pEt29a-cry1Ib2,并成功转入大肠杆菌E.coli BL21（DE3）。阳性克隆子通过PCR和核酸测序得以验证。cry1Ib2经IPTG诱导大量表达。SDS-PAGE分析说明表达的融合蛋白（包含（His）₆ tag）为81 kDa左右,与ExPASy软件预测的基本一致。蛋白可溶性试验说明该表达产物部分可溶。生物测定表明表达产物对5龄柑橘凤蝶幼虫具有杀虫活性,并且对其生长也表现出较明显的抑制作用。新cry基因的克隆,不但为cry基因家族增添了新成员,而且为构建新型转基因工程菌和转基因植物,提供了基因材料。同时,也使Cry1Ib蛋白在柑橘凤蝶的防治应用上提供了可能。笔者还总结了此菌株其他抗虫基因克隆及应用方面的成果,比较了国内外果树抗虫基因遗传转化研究所取得的重要进展,提出了当前中国果树转抗虫基因研究存在的问题及应对策略。