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树突状细胞(Dendritic cell,DC)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cell,APC),是机体免疫反应的始动者,在特异性免疫中起着十分重要的作用,与病原微生物感染发病机理和机体免疫预防都有着十分紧密的联系。近年来,DC作为重要的免疫细胞在病毒感染中的作用及其意义引起了国内外学者的广泛关注。在畜牧兽医方面,有关动物DC的研究不多,对猪DC的免疫生物学功能及其与病毒感染的关系、作用所知甚少。根据DC的功能以及在免疫中的作用,有理由推测DC在FMD的免疫功能紊乱以及发病机制中可能发挥着重要的作用。为此,本研究拟从猪外周血单核细胞诱导培养出DC,并通过形态、表型及功能等方面检测,然后用FMDV感染DC,研究FMDV对猪DC的感染性以及FMDV感染后对DC免疫生物学特性及功能的影响;从而进一步探讨FMDV感染猪的DC免疫生物学特性、功能改变与其免疫功能动态变化的关系,以及FMDV感染引起机体免疫功能紊乱的分子机制,为FMD的防控提供新的思路。
首先,我们通过分离猪外周静脉血,用贴壁法获取单核细胞,体外联合应用重组猪源GM-CSF、IL-4,经LPS诱导DC成熟。分别在光学显微镜、扫描电镜和透射电镜下观察到了诱导培养的DC具有典型的形态特征;瑞氏染色DC染成蓝色,核深染;流式细胞术检测结果表明,培养6天的DC(未成熟)表面中度表达主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子SLA-Ⅱ-DR(似人的MHC-Ⅱ类分子),高表达swCD1,表达率分别为61.50%和83.10%,低表达swCD172a,表达率为24.90%;培养8天的DC(成熟)表面高表达SLA-Ⅱ-DR(似人的MHC-Ⅱ类分子),中度表达swCD1,表达率分别为71.70%和50.10%,低表达swCD172a,表达率为19.30%。功能实验表明:未成熟DC具有吞噬异物的能力;与未成熟DC预先混合培养的淋巴细胞对与DC同一个体猪来源的淋巴细胞(T1)有较弱的应答反应,而对其它个体猪淋巴细胞(T3)的刺激相对于T1呈现出较强的应答反应;猪源DC的同种异体混合淋巴细胞反应表明,其具有刺激猪淋巴细胞增殖的能力。
然后,我们用FMDV感染诱导培养的猪DC,发现FMDV可感染DC,FMDV在DC中的滴度随时间延长而逐渐降低;间接免疫荧光法检测到了感染猪DC胞膜上的FMDV抗原;透射电镜下观察FMDV感染的DC,发现有些DC细胞核固缩、极个别DC崩解、线粒体肿胀,多数DC中溶酶体增多,并在细胞质中观察到了完整的病毒粒子;DC感染FMDV后,其内吞抗原的能力和刺激淋巴细胞增殖能力均有所下降;流式细胞术检测发现,未成熟状态和成熟状态DC感染FMDV后其表面免疫相关分子swCD1、swCD172a、SLA-Ⅱ-DR(似人MHC-Ⅱ类分子)表达均有所下降。
最后,我们用ELISA试剂盒检测了未感染的DC和FMDV感染的DC其IFN-γ和IL-10的分泌,结果表明,随时间延长未感染的DC其IFN-γ和IL-10的分泌均呈下降趋势,将分泌的IFN-γ和IL-10的pg值进行比较发现IL-10的量高于IFN-γ;FMDV感染的DC其分泌的IFN-γ和IL-10均呈上升趋势,将分泌的IFN-γ和IL-10的pg值进行比较发现IL-10的量高于IFN-γ。