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研究背景足细胞裂孔隔膜蛋白分子是肾小球滤过屏障结构和功能的重要组成部分,研究证实,nephrin、podocin、synaptopodin等足细胞蛋白分子与蛋白尿形成密切相关,成为阐明原发性肾病综合征发病机制和研发药物靶点的热点。本课题组前期采用基因芯片技术对原发性微小病变型(MCD)肾病综合征患儿的肾组织基因表达谱进行分析筛选,发现患儿肾组织中血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)表达水平明显升高,随后在阿霉素大鼠模型中也发现了类似的情况。进一步的体外实验发现,ANGPTL3可影响足细胞与基底膜(GBM)的黏附稳定,还能够引发足细胞骨架重排。以上提示ANGPTL3可能是影响足细胞裂孔隔膜结构和功能的重要因子之一。ANGPTL3是血管生成素家族的成员之一,分子量70KDa(人),主要由肝细胞合成,在正常状态下肾组织仅有微量表达。其生物学功能有促进血管生成和调节脂质代谢,以往对于ANGPTL3的研究主要集中于脂质代谢,研究发现它可以通过抑制脂酶活性,导致血脂升高,尤以甘油三酯和低密度脂蛋白为主。近期研究发现,ANGPTL3可以通过和血管内皮整合素β3受体结合来发挥其调节血管生成的生物学作用,整合素β3成为ANGPTL3的主要受体。本课题组前期的体外研究也发现ANGPTL3可以在肾小球足细胞中与整合素β3存在共定位关系,并通过激活下游信号转导通路导致足细胞骨架重排,表明整合素β3是ANGPTL3在肾脏的重要下游受体；进一步研究还发现ANGPTL3低表达可保护足细胞骨架结构在阿霉素损伤时的相对完整性。我们前期的研究充分的提示ANGPTL3与肾病时足细胞功能和蛋白尿的变化有密切的关系,但尚需整体水平上进一步深入研究,即通过ANGPTL3表达改变的动物模型来考察ANGPTL3对肾脏结构和功能的影响。体内精原细胞介导制备转基因动物的方法较传统方法获得转基因子代周期短,制作过程简单,不需要特殊的仪器。据报道,通过这种方法,FO代精子中目的基因稳定表达长达一年余,第一代转基因仔鼠可以在手术后60天左右可以获得,鉴定阳性率可高达60%。本课题拟通过精原细胞介导的转基因技术制备ANGPTL3表达上调和下调小鼠模型,考察ANGPTL3表达变化对小鼠肾脏功能及足细胞的影响；进一步在ANGPTL3表达上调和下调转基因小鼠模型的基础上,制备阿霉素肾病小鼠模型,观察ANGPTL3表达变化在阿霉素作用下对小鼠肾脏功能及足细胞结构的影响,深入探讨ANGPTL3对肾脏产生影响的可能机制,为肾病综合征发病机制的研究及治疗靶点的研发提供坚实的基础研究依据。第一部分ANGPTL3表达变化的转基因小鼠模型的制备与鉴定及其对肾脏的影响目的通过精原细胞介导的动物转基因技术制备ANGPTL3表达上调和下调的小鼠模型,了解ANGPTL3对小鼠肾脏功能及足细胞结构的影响,建立简易有效的动物转基因技术平台。方法(1)制备和线性化ANGPTL3重组质粒pcDNA3.1-ANGPTL3和小干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-ANGPTL3-miRNA;各取4周龄Balb/C雄性小鼠20只和昆明系(KM)雄性小鼠10只,分别将这二种线性化质粒20 u1(0.5ug/u1)注射入右侧睾丸内,电穿孔后复位,同时结扎摘除左侧睾丸(FO代)；(2)分别于术后1、3、6和12月取2只注射pcDNA6.2-GW/EmGFP-ANGPTL3-miRNA质粒的Balb/C雄鼠的睾丸,观察睾丸转染绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,了解F0代小鼠睾丸中目的质粒转染的情况；(3)术后35天分别与野生型雌鼠合笼交配,所产子代(F1代)以特异性引物PCR鉴定其基因型后,分为3组：ANGPTL3上调组(AT,ANGPTL3 transgenetic)、ANGPTL3干扰组(AR, ANGPTL3 RNAi)和野生型组(WT,wild-type)。每组各取5只6周龄小鼠,ELISA法检测血清中ANGPTL3水平,通过Real-time PCR、免疫组化、Western blot检测肝脏和肾皮质ANGPTL3表达,以肾脏表达情况验证NGPTL3上调和干扰效率；观察各组间小鼠表型变化；(4)检测24小时尿蛋白定量和血脂(甘油三酯和胆固醇)水平,观察肾小球结构形态；TUNEL法检测肾小球细胞凋亡情况；Real-time PCR、免疫组化和VWesternblot检测肾皮质中integrin-β3、nephrin、podocin、WT1、VEGF、LXR和synaptopdin的表达。结果(1)雄鼠睾丸注射及电穿孔手术成功率100%,术后雄鼠在适宜环境下一月内全部恢复正常状态；FO代Balb/C雄鼠术后1、3、6月,睾丸中仍表达GFP,3月时表达最强,但有逐渐减弱的趋势,术后12月消失；Balb/C和KM F0代小鼠术后各有11只(55.0%)和10只(100%)产有子代；(2)基因组PCR鉴定Fl代子鼠共298只,阳性小鼠134只(44.9%),其中AT组50.0%(66/132),AR组40.9%(68/166)；Balb/C和KM F1代小鼠PCR鉴定阳性率分别为40.0%和60.3%；AR组和AT组小鼠在外观、活动、性格等方面无明显差异；(3)小鼠血清中ANGPTL3水平：Balb/C小鼠中,AT组(32.5±2.0ug/ml)明显高于AR组(20.2±2.1ug/ml)和WT组(25.2±1.7ug/ml),AR组明显低于WT组(均P<0.05)；KM系小鼠中,AT组(40.4±2.2ug/ml)明显高于AR组(34.5±4.5ug/ml)(P=0.038),但与WT组(39.5±4.0ug/ml)无明显差异；Balb/C小鼠中肝脏和肾皮质ANGPTL3表达及mRNA水平：AT组>WT组>AR组,其中AT组明显高于AR组(均P<0.05)。以肾小球中ANGPTL3的表达变化为标准,AT组小鼠ANGPTL3上调的效率约为65.5%,AR组小鼠ANGPTL3下调的效率约为31.2%；(4)Balb/C小鼠血清甘油三酯水平：AT组>WT组>AR组,AT组明显高于AR组(P=0.040)；胆固醇三组间无明显变化；AT组体重明显低于AR组和WT组(P<0.001);Balb/C小鼠24小时尿蛋白定量、肾小球形态学和细胞凋亡水平三组间无明显差异；Balb/C小鼠肾皮质整合素(33、podocin、synaptopdin和VEGF表达及mRNA水平：AT组>WT组>AR组；而nephrin则相反,AR组>WT组>AT组；LXR和WT1表达在各组间无明显差异。小结成功地以体内精原细胞介导的转基因技术建立ANGPTL3表达上调与下调转基因小鼠模型,上调效率约为65.5%,下调效率约为31.2%。该方法制备转基因动物的子代阳性率为44.9%；ANGPTL3上调可引起血清甘油三酯水平升高,体重下降。同时ANGPTL3表达的变化可引起足细胞分子整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF和nephrin表达的变化。第二部分体内ANGPTL3表达改变对阿霉素肾病小鼠肾脏结构和功能的影响及其机制目的观察ANGPTL3表达上调和下调对阿霉素作用下小鼠肾脏功能的影响,探讨ANGPTL3对肾脏结构和功能产生影响的可能机制。方法(1)于AT组(ANGPTL3表达上调效率为65.5%,见第一部分)、WT组和AR组(ANGPTL3表达下调效率为31.2%,见第一部分)各取6周龄Balb/C雄鼠7只,尾静脉注射阿霉素10.5mg/kg,分别命名为：A-AT、A-WT和A-AR；对照组注射同等剂量生理盐水,分别命名为：AT、AR和WT。分别于第1、2、4、6周收取24小时尿液,第6周处死,留取血清和肾脏标本；(2)检测指标和方法同第二部分。结果(1)阿霉素注射后,三组小鼠24小时尿蛋白于第2周开始升高,其中,第2周时A-AR组低于A-WT组；第2周和第6周时A-AT组明显高于A-AR组(P=0.026和0.035)；第6周时血清甘油三酯水平阿霉素组均明显高于对照组,其中A-AT组明显高于A-AR组(P=0.028)；胆固醇水平：在阿霉素组较对照组升高,其中A-AT组较AT组显著升高(P=0.039),在阿霉素组内A-AT组较A-AR组和A-WT组升高,A-AR组低于A-WT组；(2)电镜下阿霉素注射三组小鼠均出现大量肾小球足突融合,其中,A-AT组较A-AR组和A-WT组小鼠足突融合更广泛,而A-AR组较A-WT组足突融合程度轻；(3)TUNEL显示阿霉素注射三组小鼠肾小球细胞凋亡均升高,其中A-AT组明显高于A-AR组和A-WT组；(4)血清中ANGPTL3水平A-AT组较A-AR组、A-WT组和AT组均明显升高(P=0.038和0.011)；肾皮质中ANGPTL3表达和mRNA水平A-AT组较A-WT组升高,A-AR组较A-WT组降低；(5)肾皮质整合素β3、synaptopdin和VEGF表达及mRNA水平A-AT组较A-AR组和A-WT组显著升高,而nephrin和WT1则显著降低,LXR在三组间无明显差异。小结ANGPTL3表达上调65%可使阿霉素肾病小鼠蛋白尿显著升高,肾脏损伤更加严重；可使阿霉素肾病小鼠甘油三酯和胆固醇水平升高更显著；可促进阿霉素作用下肾小球细胞凋亡水平,可诱导更显著的肾小球Synaptopdi、VEGF、整合素β3表达升高,以及nephrin与WT1表达降低；ANGPTL3表达下调31.2%较野生型小鼠在阿霉素作用下尿蛋白的发生延迟,可以减轻因阿霉素损伤引起的足突融合；在肾脏结构及足细胞蛋白分子表达等各方面无明显差异。结论1.精原细胞介导的动物转基因技术较传统的转基因及基因敲除技术简便经济,易于操作。F0代雄鼠睾丸电转质粒后可稳定表达6个月；F1代转基因小鼠阳性率约为45%；生殖能力及子代的转基因鼠阳性率与动物品系的不同有关,KM鼠高于Balb/C小鼠；AT组小鼠ANGPTL3表达上调的效率约为65.5%,AR组小鼠ANGPTL3表达下调的效率约为31.2%。2. ANGPTL3表达上调可引起小鼠甘油三酯升高,体重下降,引起肾脏足细胞蛋白分子整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF、nephrin等发生变化；ANGPTL3表达下调可使小鼠甘油三酯降低,足细胞各分子的变化与ANGPTL3表达上调时相反。3.在阿霉素作用下,ANGPTL3表达上调可使血清甘油三酯和胆固醇水平明显升高,并引起更严重的肾脏足细胞的损伤,血脂、肾小球细胞凋亡水平及VEGF、整合素β3等升高更明显,并且导致nephrin与WT1表达下降更显著。4.在阿霉素作用下,ANGPTL3表达下调31.2%较野生型小鼠尿蛋白发生延迟,血清胆固醇略低,可以保护足细胞的完整性,减轻因阿霉素损伤引起的足突融合；但肾脏足细胞各蛋白分子间,如整合素β3、podocin、synaptopdin、VEGF、nephrin等无明显差异,需进一步提高ANGPTL3沉默效率来观察ANGPTL3下调对肾脏可能的保护作用及其机制。