【摘 要】
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血管平滑肌细胞(VSMCs)是血管壁细胞的主要成分,维系着血管壁的结构和功能。VSMCs的增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变被认为是冠状动脉旁路移植术(CABG)后再狭窄(RS)形成
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血管平滑肌细胞(VSMCs)是血管壁细胞的主要成分,维系着血管壁的结构和功能。VSMCs的增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变被认为是冠状动脉旁路移植术(CABG)后再狭窄(RS)形成的关键病理环节。骨桥蛋白(OPN)是细胞外基质中一种重要的功能蛋白,是VSMCs由收缩型向合成型转化的重要标志,参与VSMCs的增殖分化、凋亡的信号转导调节,被认为是血管损伤修复过程中的始动因素。作为一种基因治疗方法,RNA干扰(RNAi)以其特异性、高效性成为研究的热点。慢病毒载体是基因治疗的理想载体,具有可感染分裂及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点。为此,利用RNAi技术,设计并合成针对大鼠OPN基因的小干扰RNA(siRNA)片段,通过慢病毒转染VSMCs,观察其对VSMCs的增殖及凋亡的影响,以期为进一步研究OPN功能及基因治疗奠定基础。
本课题分为两部分。
第一部分:骨桥蛋白特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定。从Genebank获得OPN基因序列,根据OPN mRNA序列,设计、合成三对大鼠OPN基因RNAi片段。磷酸化后退火,插入pLKO.1 scramble shRNA载体,构建能表达小发夹RNA(small hair,shRNA)的pLKO.1 scramble shRNA-OPN质粒载体,分别命名为pLKO.1 scrambleshRNA-OPN1、pLKO.1 scramble shRNA-OPN2、pLKO.1 scramble shRNA-OPN3,送生物公司测序鉴定。利用原代培养的VSMCs检测干扰效率,将干扰效率最高的重组质粒载体用于病毒包装。将pLKO.1 scramble shRNA-OPN、psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞,包装产生慢病毒。结果显示:pLKO.1 scramble shRNA-OPN2为干扰效率最高的质粒。靶向大鼠OPN基因的RNAi慢病毒载体构建成功,滴度满足实验需要。
第二部分:靶向大鼠OPN基因的RNAi慢病毒载体对血管平滑肌细胞增殖、凋亡的影响。以构建好的慢病毒载体感染VSMCs,使用Trizol抽提细胞总RNA,以反转录PCR(RT-PCR)检测VSMCs OPN mRNA表达水平;蛋白免疫印记法(WB)检测VSMCs OPN蛋白表达水平;通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测VSMCs细胞增殖;流式细胞仪(FCM)检测VSMCs凋亡。结果显示:重组慢病毒感染后可显著抑制VSMCs的OPN mRNA及蛋白的表达水平,并可显著抑制VSMCs的增殖、促进VSMCs凋亡。
结论:
1、成功构建了能够表达OPN小干扰RNA的慢病毒载体,能够特异、高效的沉默OPN基因。
2、用构建好的慢病毒载体感染VSMCs,能明显抑制VSMCs的增殖、促进VSMCs凋亡。
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