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羟基酪醇(Hydroxytyrosol,HT),具有很好的抗氧化、抗癌等生物活性。但由于HT含有3个酚羟基,具有亲水性强、性质不稳定等特点,且其化学合成成本高,环境污染大,目前国际上仍缺乏天然HT批量制备技术研究。本论文以橄榄苦苷提取物(Olive leaf extract,OLE)为原料,经过酶解橄榄苦苷(Oleuropein,OL)制备HT,考察其热稳定性质和脂质体性质。采用裂解气质(pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry,Py-GC-MS)和HPLC方法分析酚类产物化学成分,初步阐述酶解机制及关键多酚变化规律,同时探讨酚类产物的抗氧化和抑菌活性构效关系。这将为橄榄苦苷提取物和HT关键酚类化合物高效制备及其深加工利用提供理论和应用基础。主要研究内容如下:(1)橄榄苦苷提取物的生物酶解工艺优化及关键多酚变化规律以橄榄苦苷提取物为原料,经筛选得出专一性好的半纤维素酶能够定向诱导OL酶解,且由单因素和正交试验得到降解OLE-1(OL含量38.6%)的最佳工艺:酶解温度60℃、pH值5.5、酶的质量40 mg、时间6 h,酶解物(enzymatic hydrolysate,EH-1)中HT含量2.81%,OL降解率为85.28%。相似酶解条件下,OLE-2(OL含量81.04%)得到的EH-2中HT含量为8.64%,OE降解率为98.54%。通过对比不同含量OL的OLE(OLE-1和OLE-2)酶解结果,发现酶解后OL含量明显降低,HT含量逐渐增加。由此说明OL含量越高,得到的HT含量越高。(2)橄榄苦苷提取物的酶解机制和酚类产物化学成分通过Py-GC-MS分析了OLE-2、EH-2和EEEH-2的化学成分,其主要产物是酚酸类物质(4-羟基苯乙酸、水杨酸、3,4-二羟基苯乙酸、香草酸、3,4-二羟基苯甲酸、咖啡酸等)。采用HPLC色谱对EEEH-2进行分析,表明14种酚类产物中HT含量最高,OL几乎完全降解。裂解产物主要酚酸类物质可能与OLE中含有黄酮结构、酚羟基结构物质,以及结构类似的糖苷和黄酮苷等物质的高温裂解有关系。且推断OL、毛蕊花糖苷、女贞苷、木犀草素(或糖苷)和芹菜素(或糖苷)可能裂解得到HT、酪醇、咖啡酸和4-羟基肉桂酸等产物。OL对HT的制备起着至关重要的作用。其中,合适的酶系和温度对OL的酶解有较大影响。相关数据表明ol经半纤维素酶水解后得到大量苷元,但ht需断裂酯键才能得到,间接说明糖苷键的断裂相对酯键较容易。(3)酚类产物中羟基酪醇的分离富集工艺首先,采用乙酸乙酯萃取eh-1可将ht纯度由2.81%提至10.23%。其次,运用h-103大孔树脂纯化得到40.78%ht的树脂解附物,最后,经高速逆流色谱进一步分离,可将树脂解附物的ht纯度由40.78%提高到85.7%。(4)羟基酪醇酚类产物的热分解动力学及其稳定性利用热重-微热重(tg-dtg)分析方法,以动力学分析为基础,阐明酶解物(eeeh-1)和ht热稳定性、热分解机理以及分解动力学规律。结果显示:ht热分解一步完成,且随着升温速率的提高其热分解特征温度也呈现了分解滞后现象。ht热分解反应机理为一维扩散d1,且在氮气氛围下的理论贮存期为4~5年。酶解物热分解主要由两步完成,且其热分解特征温度也随着升温速率的提高呈现出分解滞后现象。且其热分解机理函数为三维扩散jander方程d3+三级化学反应f3。由ea和a数据可看出,酶解物热分解第一步反应比ht容易进行,但第二步难度却加大。在酶解物其它成分不变的条件下,ht含量高时会降低酶解物第二步热分解的活化能,使其稳定性减弱。(5)酚类产物的抗氧化性和抑菌性及其构效关系通过dpph自由基清除能力、abts自由基清除能力、总还原能力、铁离子还原能力和fe2+螯合能力这5种方法考察了酚类产物的抗氧化能力。结果显示,14种受试样品各受试样品均具有不同程度的抗氧化性,抗氧化能力均随着其作用浓度的增加而提高,且所有样品浓度与其抗氧化能力均呈剂量-效应关系。总体上,ht、ol、咖啡酸、3,4-二羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯乙酸、丁香酚的抗氧化性较强。酶解产物及分级萃取物的抗氧化活性结果显示,eeeh清除dpph自由基的能力最强,说明物质所含ht、ol和其他关键多酚种类和含量对其抗氧化活性有明显影响。通过对金黄色葡萄球菌(s.aureus)、表皮葡萄球菌(s.epidermidis)、大肠杆菌(e.coli)、产气肠杆菌(e.aerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)的作用来考察酚类产物的抑菌活性。结果显示,14种受试样品对各菌株有着不同程度的抑制效果,且对革兰氏阳性菌的抑制效果更好。在各受试菌株中,对表皮葡萄球菌的抑制力最强,金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌次之,对大肠杆菌的抑制作用最弱。其中,ht、OL、咖啡酸、3,4-二羟基苯甲酸均有着很好抑菌效果。酚类产物抑菌活性结果显示,EEEH-1具有一定的抑菌效果,说明该物质中各酚类化合物之间存在一定程度的协同抑菌作用。酚类产物与生物活性的构效关系是通过其化学结构的差异和对生物活性的强弱来评价。结果表明,是否具有儿茶酚母体结构和糖苷键、酚羟基的个数和具体位置、和苯环上4-取代位置是否键合供电子基团等结构因素,将很大程度上影响酚类化合物的抗氧化性和抑菌性,更取决于各种因素之间的相互作用。(6)HT脂质体制备与稳定性通过单因素和响应面试验得到HT脂质体最佳的制备工艺条件:温度63℃,卵胆比4.5,HT质量5 mg,吐温-80 6 mL,HT脂质体包封率为45.08%。相对于HT溶液,制备的HT脂质体具有一定的缓释作用,且HT脂质体对DPPH自由基的清除效果没有明显影响。