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目的:以HepG2.2.15细胞为实验模型,研究阳离子脂质体介导的针对HBV S基因反义锁核苷酸片段抗乙肝病毒的疗效,为研究和开发新型抗乙肝药提供实验依据。方法:1、HepG2.2.15细胞的鉴定:分别用PCR、酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫细胞化学法对HepG2.2.15 HBV亚型、活性及功能进行鉴定。2、筛选阳离子脂质体转染剂量及初步确定HepG2.2.15细胞的转染效率:分别用2.5、5、7.5和10μL/mL脂质体转染HepG2.2.15细胞;观察其分泌HBsAg、HBeAg量;并用MTT法检测脂质体对细胞的毒性;及凋亡染色试剂检测细胞凋亡情况。用上述四个浓度的阳离子脂质体包裹pEGFP-N1转染HepG2.2.15细胞48h后在荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光蛋白的量,以确定细胞是否易感及转染效率的高低。3、ASODN的设计:设计并合成互补于HBV mRNA S基因翻译起始位点(155～165nt)的11聚反义寡脱氧核苷酸(ASODN),分别进行LNA修饰、磷酸全硫代修饰,同时设计合成与HBV基因的无关序列作为对照。4、进一步筛选ASODN/阳离子脂质体的比例:以5和7.5μL/mL脂质体包裹PSODN观察其分泌HBsAg、HBeAg量;并用MTT法检测PSODN/脂质体复合物对细胞的毒性;凋亡染色试剂检测细胞凋亡情况。5、检测LNA体外抗核酶的稳定性:用核酸外酶切对LNA、脂质体包裹的LNA、PSODN和脂质体包裹的PSODN进行酶切,将酶切产物进行电泳后观察结果,判断修饰后的ASODN及脂质体包裹后ASODN体外抗酶切的稳定性。6、LNA体外抗HBV活性:将脂质体包裹LNA、未修饰ASODN、无关ODN及脂质体对照、拉米夫定及空白对照分别作用HepG2.2.15细胞。每隔48h收集细胞上清,连续10天检测其分泌HBsAg、HBeAg量及荧光定量PCR法检测细胞培养上清中HBV DNA含量的变化。并用MTT法检测LNA/脂质体复合物对细胞的毒性;及凋亡染色试剂检测细胞凋亡情况。结果:1、培养HepG2.2.15细胞上清中含乙肝病毒DNA,经PCR扩增结果与HBV基因ayw亚型相符,该细胞能持续分泌HBsAg、HBeAg及病毒颗粒,免疫组化HBsAg呈阳性。2、阳离子脂质体转染HepG2.2.15细胞时浓度宜小于7.5μL/mL,阳离子脂质体能抑制细胞分泌HBsAg、HBeAg,对该细胞具有一定的毒性作用(与空白对照组比较P<0.05),能诱导部分细胞凋亡。HepG2.2.15细胞对阳离子脂质体介导的pEGFP-N1易感,能表达绿色荧光蛋白。3、ASODN与阳离子脂质体的比例宜为3μg /5μL/mL。若脂质体与PSODN浓度过大,细胞分泌HBsAg、HBeAg均受抑制,细胞存活率低,凋亡现象较多见。4、经LNA修饰的ASODN在体外有良好的抗酶切稳定性。而PSODN及脂质体包裹后PSODN不能抵抗酶切作用。5、针对HBV S片段翻译起始区的各种修饰的ASODN均具抑制细胞分泌HBsAg、HBeAg(与空白对照组比较P<0.05),其中LNA组对HBsAg、HBeAg的抑制效最高达67.7%、59.7%,优于拉米夫定组。FQ-PCR结果显示细胞培养上清中HBV DNA均为阳性,LNA组抑制HBV DNA达63.3%(与空白对照组比较P<0.05)与HBsAg、HBeAg结果相符。6、LNA对HepG2.2.15细胞毒性作用较小,与脂质体对照组无明显差异。LNA能诱导HepG2.2.15细胞凋亡。结论:1、HepG2.2.15细胞具有良好的HBV表达活性,为筛选抗HBV药物的良好体外模型。2、阳离子脂质体抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg,对细胞有一定的毒性作用,并能诱导细胞凋亡。HepG2.2.15细胞对阳离子脂质体介导基因的转染易感。3、经LNA修饰的ASODN有良好的抗酶切作用。4、针对HBV S片段翻译起始区的LNA能有效的抑制病毒的分泌及病毒蛋白的表达,且对细胞无明显毒性。LNA抗HBV活性优于未修饰的ASODN、PSODN及拉米夫定。LNA为乙肝病毒感染的疾病开辟了新的途径。