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荧光互补系统(Fluorescence complementation，FC)是近来发展的一种用于体内蛋白质-蛋白质，蛋白质-RNA相互作用研究的技术。目前为止已有多种荧光蛋白用于FC系统，但由于激发波长较短(＜600nm)，还没有一种FC系统能用于活体成像。本研究将单体红色荧光蛋白mNeptune(激发峰600nm,发射峰650nm)开发为新的双分子荧光互补系统(BiFC)及三分子荧光互补(TriFC)系统，以期成为第一个用于活体成像的荧光互补系统。
本研究首先构建了mNeptune-BiFC系统并用于活细胞内蛋白相互作用的可视化。根据mNeptune的晶体结构，将mNeptune分别从2个氨基酸位点(155/156，169/170)切开，用EGFP作为弱相互作用蛋白筛选出位点155/156切割的mNeptune-BiFC系统荧光信号更强，发展了mNeptune-BiFC系统。用已知有相互作用的一组蛋白(分别为细胞转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链结构域，bFos和bJun)作为研究对象，验证了mNeptune-BiFC系统在细胞内研究蛋白质相互作用的可靠性。将mNeptune-BiFC系统进一步发展为TriFC系统。TriFC系统与BiFC系统原理相似。但TriFC系统利用的是蛋白质-RNA相互作用来使得荧光恢复，所以它被用来检测蛋白质-RNA的相互作用。利用三对已知的蛋白质-RNA相互作用，分别为流感病毒NS1蛋白和其自身编码的MmRNA5UTR及NpmRNA5UTR,人源PTB蛋白与HIV-1 Env CRS，在体内验证了mNeptune-TriFC系统的可靠性。之前的研究结果表明在病毒潜伏感染的静止CD4+T细胞的细胞核内，有HIV-1 mRNA滞留。体外实验证明PTB与这些mRNA结合，过量转染PTB使mRNA由细胞核转运到细胞质，并且引起病毒粒子的释放。利用mNeptune-TriFC系统，我们发现PTB可能与HIV-13LTR区结合，而3LTR区域参与了病毒mRNA的polyA加尾等mRNA加工过程，所以PTB可能通过与3LTR结合，与病毒或细胞因子共同作用，直接或间接促进了病毒潜伏感染的静止CD4+T细胞内HIV-1mRNA的出核。