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研究背景和目的:
目前研究发现人类卵巢癌中3q、8q及20q的部分基因发生DNA扩增，大约50%的卵巢癌和细胞系存在20q DNA拷贝数增加。目前还未精确测出20q扩增子的精确序列，但已知至少包含部分的20q12及20q13。Watanabe等发现卵巢癌中DNA拷贝数改变主要表现在6个基因：E2F1和TGIF2（20q11.2），AIB1（20q12），PTPN1（20q13.1），ZNF217（20q13.2），BTAK（20q13），其中三个扩增核心是20q11.2，20q13.1及20q13.2。乳腺癌及其它肿瘤中研究中发现20q13.2约1Mb区域发生扩增，该位点的ZNF217（zinc finger protein，217）基因是该区域最强的候选基因之一。
ZNF217基因定位于人染色体20q13.2，表达产物为ZNF217蛋白。ZNF217基因编码的Krupple样转录因子属于锌指蛋白家族。研究表明锌指蛋白家族成员在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。目前相继有报道证实ZNF217基因与乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌等发生、发展密切相关，其中在乳腺癌中的研究中证实其为乳腺癌发生发展的两个启动因子之一。Tanner等在卵巢癌患者中检测到12.5%的20q13.2位点ZNF217基因发生扩增，认为在卵巢癌患者中存在20q12-13区的DNA扩增现象。
ZNF217基因是利用PXDLS（Pro-X-Asp-Leu-Ser）基序（位于C端结合蛋白底物结合域的结合沟里）和RRT（Arg-Arg-Thr）基序（主要结合于C端结合蛋白的核苷酸结合域表面的沟），与C端结合蛋白相作用，而产生抑制转录的作用。ZNF217的拷贝数增加，基因表达会改变，例如抑制肿瘤抑制基因启动子的表达，从而导致肿瘤发生。推测ZNF217可能是序列特异性DNA结合蛋白，通过结合C端结合蛋白，沉默某个或某些基因。ZNF217在肿瘤产生方面的作用主要有：降低某些肿瘤抑制因子的表达水平，提高癌基因的表达水平，其中包括EEFIA2；ZNF217能诱导锚着非依赖性和血清非依赖性，意味着ZNF217能激活生长促进因子自分泌，并发现ZNF217基因在不同细胞内的表达差异与p53 a和pRB的状态有关。采用CAST（cyclic amplification and selection of targets）测定、免疫共沉淀法证实了ZNF217 DNA共同序列存在于人上皮细胞钙粘连蛋白启动子中。
我们的前期研究发现ZNF217基因在卵巢癌中表达升高，且与卵巢癌的分期密切相关，构建ZNF217基因沉默的shRNA表达载体，转染卵巢癌细胞株HO-8910，筛选出ZNF217基因沉默的稳定抗性单克隆细胞HO-8910/ZNF217KD，发现ZNF217基因促进卵巢癌的增殖、侵袭及运动能力。本研究利用前期实验建立的HO-8910/ZNF217KD细胞株，应用比较蛋白组学技术、基因芯片技术，结合生物信息学分析，筛选出ZNF217基因沉默后的差异蛋白质点和差异基因，再在卵巢癌组主或细胞中进行验证，探讨ZNF217基因介导的卵巢癌以及参与卵巢癌发生发展的相关基因，为阐明卵巢癌的发病机制及信号转导通路提供理论依据。
方法:
1.应用比较蛋白组学和生物信息学技术分析ZNF217基因表达下调后的蛋白表达差异位点。
利用蛋白质组学技术分离HO-8910/HK和HO-8910/ZNF217KD细胞的总蛋白，建立重复性和分辨率较好的细胞双向凝胶电泳图谱，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定差异表达的蛋白质点。利用软件过滤基线峰、识别信号峰，利用Matrixscience公司的在线软件Mascot Distiller进行搜索分析。利用Real Time RT-PCR和Western Blot从基因和蛋白表达水平上在卵巢癌细胞中或组织中加以验证。
2.应用基因芯片和生物信息学技术分析ZNF217基因表达下调后的全基因组表达谱变化。
利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片检测ZNF217基因表达沉默前后差异基因表达谱。用Gene Ontology、Panther、 Genomatix软件进行生物信息学分析，绘制ZNF217基因在卵巢癌发生发展中的信号通路图。
利用免疫组织化学法和Real Time RT-PCR对所获得的差异基因在卵巢癌细胞及组织中进行基因和蛋白表达水平的验证。
结果:
1.应用比较蛋白组学和生物信息学技术分析ZNF217基因表达下调后的蛋白表达差异位点。
比较蛋白质组学是当前蛋白质组学研究的主要策略，通过比较细胞在基因沉默前后蛋白质表达差异，发现与目的基因作用相关的蛋白质。在本研究中，与HO-8910/HK细胞相比，HO-8910/ZNF217KD细胞表达的蛋白质在数量和表达水平上发生了一定的变化，而这些发生改变的蛋白质与ZNF217的促进癌发生发展作用相关。因此，利用比较蛋白质组学的方法，分析细胞蛋白质表达的变化，可发现与ZNF217作用相关的蛋白质，从而了解其发挥作用的分子机制。在本研究中，利用蛋白质组学技术分离细胞的总蛋白，结合图像分析和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对部分差异表达的蛋白质点进行鉴定，成功鉴定了8个差异表达的蛋白质点。其中与端粒术端转移酶互相作用的SMG-6基因在ZNF217基因沉默后表达降低，说明ZNF217基因可能也与端粒酶的活性有关。因此推测SMG6蛋白可能与卵巢癌发生机制相关的蛋白质。
2.应用基因芯片和生物信息学技术分析ZNF217基因表达下调后的全基因组表达谱变化。
利用Affymetrix公司制备的Human Genome U_133plus2原位合成寡核苷酸芯片对HO-8910/ZNF217KD和HO-8910/HK细胞的基因表达谱进行分析，对获得的下调基因进行信号通路分析，发现3个主要的信号网络簇，ZNF217基因处于核心位置，ZNF217基因沉默后94个与肿瘤的凋亡、侵袭及转移有关的基因表达下调达8-64倍。采用Real Time RT-PCR验证ALOX15，CDID，FXYD3，GAS6，KRT4，LIN7B，MMP-24，PDZK1，PEX6，PRSS8，SLC2A9，STRN，WFDC2卵巢癌细胞中的表达，结果与基因芯片是一致的，说明基因芯片的结果是可靠的。其中MMP家族中MMP-2，7，9，21，24，28基因下调8-32倍，免疫组织化学法检测这些基因在卵巢癌转移组织中的蛋白表达，发现这些基因与卵巢癌的转移密切相关，结合ZNF217基因沉默后与下调基因介导的卵巢癌信号通路图分析，认为MMP-2，7，9，21，24，28基因可能参与卵巢癌的转移过程。
3.ZNF217差异基因和/蛋白质筛选过程中的转录组和蛋白质组的对接
在本研究中，我们利用基因芯片和比较蛋白质组学技术筛选与ZNF217作用的基因和/蛋白质，转录组和蛋白质组对接的基因/蛋白质有1个，与ZNF217基因功能协同的KRT17，它随着ZNF217基因的表达沉默而下调。
结论:
1.ZNF217基因直接或间接调控卵巢癌的相关基因。
2.与ZNF217基因具有协同作用的KRT17，与ZNF217基因关系密切，可能参与卵巢癌的发生发展过程。
3.MMP2，7，9，21，24，28与ZNF217基因关系密切，可能参与卵巢癌的转移过程。
4.ZNF217基因可能通过SMG-6激活端粒酶的活性，从而使卵巢细胞呈永生化状态，导致卵巢癌的发生。
本研究的创新之处:
1.将比较蛋白质组学与基因芯片技术相结合，实现了转录组和蛋白质组的对接；
2.将前期实验的RNAi技术与本研究的蛋白质组学和基因芯片技术相结合，用于ZNF217基因介导的相关基因的研究，为阐明ZNF217基因在卵巢癌中的作用提供新的证据，并综合分析ZNF217基因的信号转导通路，发现ZNF217基因位于3个基因簇的核心；
3.发现2个参与ZNF217信号通路的新成员，发现MMP家族中的部分成员与卵巢癌的转移相关。