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云南松（Pinusyunnanensis）是云南省主要的用材树种和分布最广的乡土树种，分布面积占云南森林面积的70％，云南松树脂含量高，每株在一个产脂季节平均产脂3-4kg，树皮中含有鞣质，枝、叶、幼果、花粉、树脂皆可药用，从而具有很高的经济价值，以前对云南松遗传改良的研究主要集中在遗传多样性、优良林分的选择、种源试验及选优、母树林改建及子代测定、遗传增益的研究等，近年来随着分子标记技术的发展，对云南松的研究逐渐从传统的形态学和遗传育种研究过渡到微观的分子方面的研究，这必将推进林木育种学的工作，为控制重要经济性状的数量性状基因定位和分子标记辅助选择奠定了基础。本研究利用ISSR（Inter-simple Sequence RepeatsISSR，简单序列重复间区多态性）分子标记技术对云南松同一棵树上的95颗胚乳进行多态性分子扩增，并进行遗传图谱构建的初步研究，为以后的云南松完整的连锁图谱的构建、分子标记辅助选择育种、重要基因的克隆与定位提供分子水平上的参考和理论依据。本研究的主要内容如下：
（1）DNA提取：以云南松胚乳为试验材料进行胚乳基因组DNA的提取，并分别采用CTAB和SDS法提取胚乳DNA，通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度技术和ISSR-PCR扩增三种方法对所提取的DNA进行检测、比较DNA的质量、产量，结果表明，两种方法均能得到高产量的DNA，但CTAB法得到纯度低，SDS法提取的DNA产量高、杂质少、ISSR-PCR扩增条带清晰、多态性好。
（2）ISSR-PCR反应体系的建立：通过研究影响ISSR-PCR反应体系的主要因子：模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、dNTPs浓度、退火温度对反应体系的影响，建立并优化了云南松ISSR-PCR反应体系：20μLPCR反应体积中，buffer（10mmol/L Tris-HCl，50mmol/LKCl，0.1％Triton X-100 pH9.0）2μL，0.4pmol/L-1引物，2.0 mmol/LMgCl2，0.5U TaqDNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTPs，30ng模板DNA，引物（GA）8的最适退火温度为52.5℃。扩增程序为：94℃预变性5min一个循环，94℃变性40s，52.5℃（或50℃）退火70s，72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃终延伸10min。
（3）引物的筛选：通过对31条引物初筛和复筛，共筛选出11个能扩增出清晰、稳定并具有多态性位点的ISSR引物，为别为：P00、P02、P04（退火温度为50℃），P06、P09、P15、P16、PH1、PH2、PH4、PH5、（退火温度为52.5℃）。
（4）数据采集和统计分析：对所有DNA样品进行PCR扩增后，经凝胶电泳检测，并用IVP凝胶成像系统拍照分析，记录时，ISSR标记名称用引物名加扩增片段的碱基长度表示，在进行多态性谱带的判读时，某一谱带出现的个体在该位点记为“1”，该谱带不出现的个体在该位点记为“2”，对于难于判断的谱带按缺失数据处理，记为“0”，最后用mapmaker3.0软件进行分析。
（5）云南松遗传连锁框架图的初步建立：通过利用所筛选出的11个引物对95个样品个体进行多态性扩增，将39个标记中的19个标记分成了3个连锁群（包括连锁对），还有20个未连锁的标记，该框架图记覆盖的基因组总长度为413cM，标记间平均距离为21.7cM，最长的连锁群达213.8cM，包含有10个ISSR标记；最短的连锁群长27.5cM，包含2个标记。标记间的最大图距为49.2cM。