PCR技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的研究

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阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌血症、小肠结肠炎,并可能引起神经功能紊乱,造成严重的后遗症,死亡率高达20%~50%以上,引起世界范围内的广泛关注。通过研究发现婴儿配方奶粉是其主要的感染源。传统方法操作繁琐,检测时间长,且灵敏度较低。本研究利用FTA滤膜与PCR技术相结合的方法建立了一套从婴儿配方奶粉中快速检出阪崎肠杆菌的方法,缩短了阪崎肠杆菌的检测时间,提高了灵敏度。本研究以阪崎肠杆菌的16S rRNA基因为靶基因,选择特异性引物,进行PCR扩增,检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌。对PCR反应体系中镁离子浓度、引物添加量及退火温度和循环数进行优化,以确定适宜的PCR反应体系和扩增程序,其适宜反应体系为:6μL10×PCRbuffer,4μLdNTPs混合物,2.5 Mg2+μL(25mM),2μL10μmol正向引物,2μL10μmol反向引物,0.25μL(5U/μL)Taq,23.25μL水,总反应体系为50μL;其适宜的PCR扩增程序为:PCR反应采用冷启动,95℃预变性5 min;变性95℃1 min~退火61℃0.5 min进行35个循环。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统观察结果。对扩增产物进行了测序,PCR扩增产物序列与文献报道的靶基因序列的同源性达100%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。本研究共检测了16株菌,以验证引物的特异性,结果表明:4株阪崎肠杆菌均为阳性结果;12株其它菌株均为阴性结果。因此该引物特异性强,可用于检测阪崎肠杆菌。采用FTA滤膜制备模板进行PCR扩增,其方法的灵敏度为7×101 cfu/mL。采用FTA滤膜制备模板,利用PCR技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌,以确定检出限。结果表明,经过4h增菌后婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检出限为7×100cfu/100g。可在6h内完成对婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的检测,比目前普遍采用的传统检测的方法缩短了12-22h。比较了检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的6种模板制备方法,结果表明FTA滤膜法可高效从样品中提取阪崎肠杆菌DNA,可有效的消除PCR反应的抑制因子,灵敏度高、操作简便、耗时短,该方法明显优于其他方法。对实际样品进行检测,将本方法与行业标准SN/T 1632.1-2005方法进行比较,确定本方法敏感性为100%,特异性为98.2%符合率为98.2%。本研究方法使用FTA滤膜法制备模板DNA,可高效的提取样品中的DNA,有效的消除PCR反应抑制因子,操作简便,为PCR快速检测食品中的致病菌构建了一个技术平台。
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