稻瘟病菌分泌蛋白致病性分析及其与水稻悬浮细胞互作研究

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本文以cH-63和TH-16两个致病性差异的稻瘟病菌株为材料,在缺氮培养条件下进行液体培养。经培养2d后,采用铵盐沉淀及透析纯化处理获得稻瘟病菌培养滤液中的分泌蛋白。分别采用致伤接种及浸泡处理对该蛋白作用水稻植株后的病理反应进行系统研究,结果表明经致伤接种的水稻叶片及茎杆接种斑处出现明显的坏死病斑,其病斑直径是对照的2~4倍。浸泡处理的水稻幼根出现严重褐化,植株生长矮小,株高仅为对照的1/2。对该分泌蛋白进行酶解处理后病症消失或减弱,进一步确证其为引起上述病理反应的主要因子。将该分泌蛋白接种24个水稻单基因系,根据接种后72h病斑长度将24个IRRI水稻单基因品种按抗、中、感病性状分组。对稻瘟病菌CH-63和TH-16的致病力进行比较,结果表明CH-63致病力强于TH-16,经苔盼蓝染色检测,也证明二者致病力强弱差异。 以24个IRRI水稻抗稻瘟病单基因系和普感品种丽江新团黑谷(LTH)的成熟种胚为材料,在诱导培养基Ⅰ和Ⅱ中诱导愈伤组织,经检测发现愈伤组织诱导率在15%-97%之间。将2,4-D浓度从3.0mg/L提高到5.0mg/L时,可提高愈伤组织诱导率。诱导的愈伤组织继代培养一定时间后,取生长状态良好的愈伤组织,构建水稻悬浮细胞系,悬浮培养过程中对胚性悬浮系的细胞形态变化进行观察,发现细胞的形状由开始不规则、长条形逐渐转变成近椭圆形、椭圆形;细胞质由淡、透明、具明显的大液泡逐渐转变成浓厚、不透明、较小的液泡。本研究建立14种水稻基因型材料的悬浮细胞系,探讨水稻胚性悬浮细胞系建立过程中的关键性技术问题,总结愈伤组织继代改良的相关措施,发现基因型、培养基成分和继代方法等是影响胚性悬浮细胞系建立的重要因素。 以感病品种LTH和抗病品种IRBL-9的水稻悬浮细胞系作为材料,对稻瘟病菌致病性分泌蛋白接种后引起“活性氧”浓度变化进行检测.结果表明经接种后,感病与抗病品种在前12h均出现活性氧进发,并且均出现两个峰值,仅在峰值时间及浓度大小上存在差异。通过比较稻瘟病菌株TH-16和CH-63分泌蛋白接种后HzO2浓度变化特征,发现分泌蛋白致病性强弱与H2O2浓度变化呈正相关,CH-63产生的强致病性分泌蛋白引起活性氧浓度的快速增加,而且IRBL-9比LTH增长幅度大。TH-16产生的弱致病性分泌蛋白接种后活性氧浓度增加不明显,IRBL-9与LTH产生的活性氧浓度变化差异较小。通过上述研究对于深入了解稻瘟病菌与水稻之间的相互识别,信号传导和应答过程,阐明水稻对稻瘟病菌的抗性机制、水稻与稻瘟病菌互作的分子机理具有重要意义。
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