论文部分内容阅读
背景：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。通过调节磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号及其下游信号途径,mTOR在细胞生长、存活和肿瘤耐药中起关键作用。在细胞中mTOR以复合物形式存在：mTOR与raptor、mLst8、Deptor和PRAS40构成了mTORC1。mTORC1对雷帕霉素敏感,能磷酸化S6激酶1(p70S6K1)和真核生物起始因子4E结合蛋白-1(4E-BP1),促进蛋白质翻译。mTOR与rictor、mLst8、mSin1、Deptor和Protor形成了mTORC2。mToRC2对雷帕霉素不敏感,可以磷酸化Akt(S473)。这两种复合物通过接受营养、氧气、能量、压力和生长因子等细胞内外信号,调控蛋白翻译、代谢、细胞生长增殖、存活和自噬等多种生理过程。超过50%的恶性肿瘤存在mTOR信号通路的过度激活,因而mTOR是重要的癌症药物治疗靶标。第一代nTOR抑制剂雷帕霉素及其类似物能抑制癌细胞的增殖,但它们仅在少数癌症的治疗中取得较好疗效,如细胞淋巴瘤,肾癌和子宫内膜癌,多数肿癌病人对雷帕霉素不敏感。引起雷帕霉素抵抗的主要原因是：1)雷帕霉素不能完全抑制nTORC1,虽然p70S6K1被强烈抑制,但是4E-BP1和mRNA的翻译却对雷帕霉素不敏感；2)不能抑制1nTORC2的活性；3)存在nTORC1和Akt之间的负反馈通路。雷帕霉素类似物可以通过抑制S6K1活性,进而抑制胰岛素受体底物(IRS-1)的降解,使Akt活性升高并促进细胞存活。最近开发的第二代mTOR抑制剂是针对mTOR激酶结构域的ATP-竞争性抑制剂,不但可抑制mTORC1,也可抑制mTORC2与Akt的负反馈激活。体内外实验研究证明这类药物有很好的抑制多种肿瘤效果,部分mTORC1/2抑制剂正处于临床试验阶段。阐明mTORC1/2抑制剂对各种癌症的治疗作用及其抑制肿瘤的细胞与分子生物学机制可为这些药物的临床应用提供理论基础和指导。此外,最新的癌症生物学研究表明：nTORC2在一些癌症的发生与进展中起重要作用,nTORC2将成为一种很有前景的肿瘤治疗靶标,阐明mTORC2在各种肿瘤发生与进展中的作用,探讨靶向mTORC2对这些肿瘤的抑制作用及其细胞与分子生物学机制可为特异靶向mTORC2的癌症治疗提供理论依据。目的：mTORC2在乳腺癌发生与进展中的作用以及特异靶向mTORC2对乳腺癌的影响与机制尚不清楚。本研究通过乳腺癌细胞系与乳腺癌移植瘤动物模型,探讨抑制mTORC2对乳腺癌细胞生长增殖、迁移和凋亡的影响及其分子机制,为靶向mTORC2治疗乳腺癌提供依据。方法：本实验分为体外实验和体内实验两个部分。在体外实验中,以多种乳腺癌细胞系为模型,使用PP242和OSI027这两种第二代mTOR抑制剂(mTORC1/2激酶抑制剂),以及siRNA分别敲低raptor、rictor或mTOR,比较靶向抑制mTORC1或(与)mTORC2活性对乳腺癌细胞生长、增殖、迁移及凋亡等的影响。在细胞增殖实验中,采用MTT和克隆形成方法研究PP242、OSI027和雷帕霉素在七种乳腺癌细胞中对细胞增殖的影响；在细胞迁移实验中,研究siRNA敲低raptor与rictor、使用PP242和OSI027两种mTOR激酶抑制剂对细胞迁移的影响；在诱导细胞凋亡实验中使用碘化吡啶(PI)染色实验与Western Blot检测活化的凋亡相关蛋白如活化状态的多聚腺苷二磷酸-核糖-多聚酶(cleaved-PARP)的表达,观察siRNA敲低raptor或rictor,或使用PP242和OSI027两种mTOR激酶抑制剂对乳腺癌细胞凋亡的影响,并进一步观察PP242、OSI027与顺铂联合使用是否具有协同效应；Western Blot检测siRNA敲低raptor或rictor,或PP242和OSI027对mTORC1和mTORC2下游信号分子S6K1、4E-BP1、S6及Akt磷酸化水平的影响；在体内实验中,比较PP242和雷帕霉素对裸鼠乳腺移植瘤生长、mTOR信号通路活性以及肿瘤细胞凋亡的影响。结果：LmTOR激酶抑制剂PP242和OSI027靶向nTORC1/2信号通路并可有效抑制乳腺癌细胞增殖在乳腺癌细胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231和Bcap-37中,同时靶向mTORC1/2的抑制剂PP242和OSI027可剂量依赖地(50-500nM)抑制mTORC2下游底物分子Akt(S473)的磷酸化,而雷帕霉素因负反馈调节引起Akt(S473)磷酸化水平的升高。虽然所有的抑制剂都能抑制S6(S235/236)的磷酸化,但是只有mTOR激酶抑制剂PP242、OSI027能更有效地降低4E-BP1(T37/46)磷酸化。这些结果表明,mTOR激酶抑制剂能有效的抑制mTORCl和mTORC2,但是雷帕霉素只能抑制mTORC1并负反馈增强Akt(S473)的磷酸化。我们进一步检测了PP242、OSI027对七种乳腺癌细胞系中的增殖抑制效果。MTT与克隆形成实验均发现靶向nTORC1和mTORCl/2可有效地抑制这些乳腺癌细胞的生长与增殖。2.靶向mTORC2而不是mTORCl可促进乳腺癌细胞凋亡Akt是促进细胞存活的关键信号通路,雷帕霉素在MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37中通过负反馈通路激活Akt,而mTOR激酶抑制剂PP242和OSI-027能抑制mTORC2与Akt的活性。与PP242和OSI-027抑制Akt磷酸化的结果一致,这两种药物能明显增强活化状态的PARP (cleaved-PARP)的表达并增加血清饥饿下MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37凋亡细胞的数目。进一步的研究发现：MCF-7和MDA-MB-231细胞中敲低raptor、mTOR和rictor表达后可明显降低S6(S235/236)和/或Akt(S473)的磷酸化,敲低rictor和mTOR而不是raptor能促进cleaved-PARP的表达和增加血清饥饿诱导的细胞凋亡。因此,靶向mTORC2而不是mTORC1能促进乳腺癌细胞的凋亡。3.在乳腺癌细胞中抑制mTORC2能增强顺铂诱导的细胞凋亡顺铂是一种常规化疗药,目前应用在多种癌症的化疗上,可以诱导一系列癌细胞的凋亡。药物联合指数(CI)分析是一个全面分析多药物联合效应和拮抗效应的方法。CI方法可以解决两种药物是否有协同效应和在什么浓度范围内有协同效应。我们进一步研究了mTOR抑制剂是否与低剂量顺铂有药物协同效应。结果发现,低浓度(20-400nM)PP242和OSI027与顺铂(200nM)共同作用于MCF-7、MDA-MB-231和Bcap-37细胞时,CI值低于1.0,表明PP242与OSI-027和低浓度顺铂有协同效应。而雷帕霉素与顺铂共同作用时,CI值高于1.0,表明没有协同效应。而且PP242和OSI027,而不是雷帕霉素能增强顺铂诱导的cleaved-PARP表达增加。rictor和mTOR的敲低而不是raptor的敲低能增强cleaved-PARP表达和增加凋亡细胞数目。这些结果表明,靶向1nTORC2而不是mTORC1能增强顺铂诱导的细胞凋亡4.靶向mTORC2可抑制乳腺癌细胞的迁移转移是导致乳腺癌病人死亡的重要原因,在肿瘤转移中癌细胞侵入周围组织和血管是转移的第一步,它需要乳腺癌细胞的迁移。我们通过划痕愈合实验研究了mTORC1和mTORC2在乳腺癌细胞迁移中的不同作用。PP242、OSI027,或转染nTOR、rictor siRNA比雷帕霉素或转染raptor siRNA能更显著地抑制MCF-7细胞迁移。在MDA-MB-231也中可以看到同样的结果,这些结果进-步证实了mTORC2在乳腺癌细胞迁移中的关键作用。5.口服PP242而不是雷帕霉素能有效抑制乳腺肿瘤的生长并诱导乳腺肿瘤细胞凋亡我们通过体内实验进一步比较靶向mTORC1和mTORC1/2对乳腺癌移植瘤的抑制效果。裸鼠接种MDA-MB-231后,口服雷帕霉素和PP242。单独使用PP242可显著抑制肿瘤的生长(肿瘤的表面积和重量),而单独使用雷帕霉素却不能显著抑制乳腺癌移植瘤生长。口服PP242而不是雷帕霉素能明显诱导乳腺移植瘤细胞凋亡。与体外实验结果一样,PP242在体内也能同时抑制mTORC1(P-S6)和mTORC2(P-Akt),而雷帕霉素只能抑制mTORC1(P-S6),而不能抑制mTORC2。这些结果表明靶向mTORC1/2而不是mTORC1能有效抑制乳腺肿瘤的生长和促进乳腺癌细胞凋亡。结论：在乳腺癌细胞中,mTOR激酶抑制剂Pp242和OSI027能明显抑制mTORC1和mTORC2信号途径,而雷帕霉素仅能抑制mTORC1和并导致Akt的负反馈激活。靶向mTORC2而不是mTORC1能诱导乳腺癌细胞的凋亡和抑制乳腺癌细胞的迁移,还能明显加强化疗药物顺铂的凋亡诱导作用。体内实验也表明靶向抑制mTORC1/2而不是mTORC1能明显抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。因此,mTORC2可能在乳腺癌发生与进展中起重要作用,靶向mTORC2信号通路比靶向mTORC1在乳腺癌临床治疗中有更大的优势。本研究也为mTOR激酶抑制剂及其与顺铂联合使用治疗乳腺癌提供了依据。