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随着免疫功能低下病人数量的增加,条件致病性真菌病的患者数量也不断增加。其中白念珠菌是临床中最常见的引起真菌病的病原体；新型隐球菌由于HIV感染者数量的增加,检出率也不断增加。早期诊断白念珠菌和新型隐球菌的感染,可使感染者获得及时的抗真菌治疗,对提高其生存率具有重要意义。白念珠菌(Candida albicans, C.albicans)与人类的关系比较复杂,通常情况下它主要存在于人的皮肤和黏膜表面而不致病称为定植(colonization)。在某些特定的条件下,如宿主免疫系统防御能力下降,黏膜损伤或肠道菌群失调时,白念珠菌就可以引起浅部和深部的黏膜感染导致念珠菌病(candidiasis)。当人的免疫系统受到严重破坏,如HIV感染,癌症化疗,器官移植时,白念珠菌就能感染深部组织和器官,甚至有机会进入血流导致严重的危及生命的念珠菌血症,引起全身感染,成为侵袭性念珠菌病(Invasive candidiasis, IC)。准确区分白念珠菌的定植和感染,既可以防止抗真菌药物滥用,又可以帮助临床医生及时采取抗真菌治疗。采用传统方法早期诊断念珠菌病存在一定的局限性。首先念珠菌病的临床表现没有特异性,临床医生不能通过患者感染症状进行早期诊断；其次痰、尿和分泌物等开放性标本直接涂片染色检查的检出率较低,而它们的培养容易因污染导致假阳性,而且无法区分定植和感染,诊断念珠菌病意义不大；深部组织的病理学诊断因取材易造成患者严重并发症而增加了诊断风险,使诊断方法应用受到限制：血培养目前被认为是侵袭性念珠菌病的诊断“金标准”,然而约50%-30%经病理学证实的侵袭性念珠菌病患者血培养为阴性,而且菌种的鉴定和药敏试验需数天时间,耗时长,很难用于念珠菌病的早期诊断。念珠菌病的早期诊断主要依赖于念珠菌菌体抗原成份及其抗体的检测。目前商品化的诊断念珠菌病的抗原、抗体主要有p-D-葡聚糖(β-D-glucan, BDG)、甘露糖(mannan, Mn)和甘露糖抗体(anti-mannan, A-Mn)。 BDG为除了隐球菌属和接合菌属外的真菌细胞壁成份,是诊断广泛侵袭性真菌病的诊断标志(aPanfungal Marker),BDG对念珠菌病的诊断缺乏种属特异性,通常要与半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)联合诊断念珠菌病,当BDG检测阳性而GM阴性时,提示念珠菌感染,当BDG和GM都为阳性时,则提示曲霉菌感染。而且BDG对于血液透析,重度粘膜炎,全身性细菌感染,抗生素治疗患者易出现假阳性；Mn是念珠菌细胞壁的主要成份之一,也是念珠菌进入人体循环系统后释放的主要抗原。Mn和A-Mn由于无法区分念珠菌的定植和感染,导致各研究因选择研究对象的差异,灵敏度和特异性报道差异较大。Mn和A-Mn多见于诊断侵袭性念珠菌病的研究报道,但多数研究为病例对照研究,缺乏随机对照研究因而无法准确评价它们对侵袭性念珠菌病的诊断意义。随着分子生物学技术的发展,念珠菌病的早期诊断还包括基因检测。但基因检测还存在较多问题,如区分定植与感染,标本的外源性污染而引起的假阳性,菌体细胞壁干扰菌体裂解和DNA释放,易引起假阴性等。此外,还有方法学标准化难,对实验环境的配置、操作的规范和人员要求高等局限,无法满足念珠菌病的常规检测。因此,寻找能够区分念珠菌定植与感染的特异性强的抗原、抗体标志物,是目前诊断念珠菌病的重点和难点问题。质谱分析发现Csa2蛋白是白念珠菌菌丝分泌的一种小分子量的蛋白质,没有信号肽结构,在白念珠菌菌丝培养上清中含量丰富,在酵母培养上清中含量不明显,由此推断Csa2蛋白可能在菌丝体表面大量表达,脱落后进入血液循环。对于它的确切功能目前还不清楚。通过系统发育分析(Phylogenetic analysis)寻找Csa2蛋白同源基因,发现CSA2基因与热带念珠菌(Candida tropicals)、粗球孢子菌(coccidioides immitis)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的CFEM (Common in several Fungal Extracellular Membrane proteins)结构域基因具有同源性,Csa2蛋白分子结构中具有含8个半胱氨酸的CFEM结构域(CFEM domain),因此推断Csa2蛋白是CFEM家族成员。白念珠菌最主要的毒力因素就是由酵母转化成菌丝。失去转化能力的白念珠菌毒力消失。菌丝更容易粘附和入侵宿主组织,造成深部感染；酵母转化成菌丝可逃避吞噬细胞的吞噬；菌丝生长的相关基因也参与菌体生物被膜的形成,与抗真菌制剂耐药密切相关。因此白念珠菌菌丝是人体内主要的致病形态。本研究以Csa2蛋白为靶标,分别建立双抗体和双抗原夹心ELISA和间接ELISA诊断念珠菌病,期望提高诊断念珠菌病,尤其是侵袭性念珠菌病的特异性和灵敏性,避免白念珠菌定植对念珠菌病诊断的干扰,弥补BDG、Mn和A-Mn诊断念珠菌病的不足。隐球菌病(Cryptococcosis)多见于免疫功能低下患者,尤其是HIV感染者。通常情况下,新型隐球菌最常累及的器官为肺和脑,但隐球菌也可导致其它器官的播撒性感染。HIV患者新型隐球菌感染的致死率为10%-40%。早期诊断新型隐球菌感染可及时挽救患者生命。目前,隐球菌病的诊断主要是使用印度墨汁(Indian ink)进行荚膜染色或使用粘蛋白胭脂红mucicarmine)进行肉芽组织切片多核巨细胞内真菌荚膜染色显微镜下检测新型隐球菌(Cryptococcus neoformans, C.neoformans);从感染标本真菌培养物中分离检出隐球菌,这些感染的标本包括脑脊液、血液、活检组织、呼吸道分泌物及患者的其它临床标本,是诊断隐球菌病的“金标准”；上述两种方法都有一定的局限性,直接显微镜下观察法的隐球菌检出率较低,真菌培养的时间过长,通常需要数天时间,不利于新型隐球菌感染的早期诊断和早期治疗。检测感染患者血清或脑脊液中新型隐球菌的抗原成为诊断其感染的重要手段。当前商业化的抗原检测方法主要是乳胶凝集试验和双抗体夹心ELISA法,其靶抗原为新型隐球菌的葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan, GXM)。GXM含量丰富,在新型隐球菌的A、B、C和D血清型中都可检测到。但是不同血清型的GXM甘露糖骨架上氧乙酰化和木糖替代程度不同。因此不同血清型的新型隐球菌诊断敏感性不同。此外,患者血清中的类风湿因子、恶性患者肿瘤血清、琼脂、脱水剂污染的血清可引起假阳性,而少量变异新型隐球菌、低GXM的脑脊液标本的突变体可导致假阴性；GXM还与毛孢子菌属、毛霉菌属、青霉菌属、组织胞浆菌属的真菌发生交叉反应。鉴于GXM对新型隐球菌诊断的局限性,选择一种结构保守的分泌性抗原为靶标,可减少GXM诊断的假阳性和假阴性。2008年Liu OW等首先通过新型隐球菌全基因序列分析和同源基因替代的方法发现CPL1基因,并证实Cpll蛋白与新型隐球菌的荚膜形成有关。新型隐球菌最重要表型特征是在菌体外有一层厚荚膜,这层厚荚膜也是新型隐球菌的重要毒力因素。荚膜变薄或消失的突变株毒力显著减弱或消失。研究表明,敲除CPL1基因,新型隐球菌荚膜变薄,失去毒力作用。由于CPL1基因中有编码信号肽的序列,因此推测Cpll蛋白可能为一种分泌蛋白。本研究中,我们证实Cpll蛋白为新型隐球菌特异性分泌蛋白并建立以Cpll抗原、抗体为靶标的ELISA检测方法,以期弥补GXM因血清型不同引起的检测灵敏性差异。本研究共分两部分,主要有以下内容：第一篇白念珠菌Csa2蛋白抗原、抗体检测ELISA法的建立及其在白念珠菌尿患者中的初步应用1、白念珠菌特异性Csa2蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立和评价构建pPIC9K-CSA2重组表达载体,使用毕赤酵母表达系统(GS115)优化表达CSA2基因,获得重组Csa2(recombinant Csa2, rCsa2)蛋白并通过镍亲和层析纯化蛋白,经SDS-PAGE鉴定rCsa2分子量约为13.3kDa。纯化rCsa2蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠,制备多克隆抗体血清,纯化兔抗血清,测得纯化兔抗IgG抗体浓度为20.5mg/mL。以RPMI-1640培养基培养白念珠菌菌丝,分别留取培养18小时、40小时、64小时、88小时、112小时、148小时和160小时的培养上清,当培养112小时后,Csa2蛋白表达量为最高值,随后的培养时间内,培养上清中Csa2蛋白含量达到动态平衡。间接免疫荧光染色发现,Csa2蛋白主要位于白念珠菌菌丝,而白念珠菌酵母,光滑念珠菌则没有Csa2蛋白表达,以正常兔血清代替兔抗血清的白念珠菌菌丝荧光染色也没有荧光的非特异性结合。以rCsa2纯化兔抗IgG与免疫豚鼠血清建立Csa2双抗体夹心ELISA方法,经棋盘滴定法确定最佳反应条件：以20ug/mL的纯化兔抗IgG包被96孔板,1：500稀释的豚鼠抗体血清为捕获抗体,1：1500稀释的辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗豚鼠抗体为二抗。分别检测一系列已知浓度的rCsa2和倍比稀释的白念珠菌菌丝培养上清,可检测rCsa2最低浓度为240pg/mL和最高64倍稀释的菌丝培养上清,具有较高的检测灵敏度；检测其它10种临床可见的致病性真菌：新型隐球菌,5种曲霉菌(烟曲霉菌、黄曲霉菌,土曲霉菌、黑曲霉菌、构巢曲霉菌),马尔尼菲青霉菌和光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌的培养上清。结果本方法与其它真菌培养上清无交叉反应,具有较高的检测特异性。2、白念珠菌特异性Csa2双抗原夹心ELISA方法的建立和评价应用改良过碘酸钠法对rCsa2蛋白标记HRP (rCsa2-HRP),通过棋盘滴定法确定0.1ug/mL的rCsa2蛋白为捕获抗原,1：1000倍稀释的rCsa2-HRP为检测抗原,建立检测Csa2抗体的双抗原夹心ELISA.检测一系列倍比稀释的rCsa2蛋白免疫兔抗血清、正常兔血清、新型隐球菌rCpl1蛋白免疫兔血清、烟曲霉rAfmp1p和rAfmp4p蛋白免疫兔血清、马尔尼菲青霉菌rMp1p蛋白免疫兔血清。该方法可检测最高稀释16000倍的rCsa2免疫兔抗血清,具有较高的检测灵敏度；并且与正常兔血清和其它4种真菌重组蛋白免疫兔血清无交叉反应,具有较高的检测特异性。3、白念珠菌Csa2蛋白抗原、抗体检测ELISA法在白念珠菌尿患者中的初步应用与评价。应用建立的Csa2双抗体夹心ELISA检测324例健康体检人群血清,确定方法的cutoff值(cutoff值=均数±3倍标准差)为0.416；以23例白念珠菌尿患者的血清为病例组,324例健康体检人群血清,4例热带念珠菌尿、2例克柔念珠菌尿、1例近平滑念珠菌尿患者血清为对照组,应用统计软件SPSS13.0计算分析,病例组血清中5例Csa2抗原检测阳性,检测灵敏度为21.74%(5/23)；对照组中2例健康体检人群血清Csa2抗原检测阳性,1例热带念珠菌尿患者血清阳性,其余全部为阴性,检测的特异度为99.09%(328/331)；诊断阳性预测值71.43%(5/7)；阴性预测值为94.80%(328/346)。应用建立的Csa2双抗原夹心ELISA检测324例正常健康体检人群血清,确定方法的cutoff值(cutoff值=均数±3倍标准差)为0.072；以23例白念珠菌尿患者的血清为病例组,324例健康体检人群血清,4例热带念珠菌尿、2例克柔念珠菌尿、1例近平滑念珠菌尿患者血清为对照组,应用统计软件SPSS13.0计算分析,病例组血清中15例Csa2抗体检测阳性,检测的灵敏度为65.22%(15/23)；对照组中1例热带念珠菌尿患者血清阳性,检测的特异度为99.70%(330/331),诊断阳性预测值97.75%(15/16)；阴性预测值为97.63%(330/338)。应用统计软件SPSS13.0计算分析,两种方法联合检测病例组血清中,4例Csa2抗原、Csa2抗体检测皆阳性,1例Csa2抗原检测阳性,9例Csa2抗体检测阳性,诊断的灵敏度为69.56%(16/23)；对照组血清中有2例健康体检人群血清Csa2抗原检测阳性,2例热带念珠菌尿患者血清Csa2抗体为阳性,检测的特异度为98.79%(327/331)；诊断阳性预测值80.00%(16/20)；阴性预测值为97.90%(327/334)。建立以Csa2抗体为靶标的间接ELISA,通过棋盘滴定法确定1.0ug/mL的rCsa2蛋白为包被抗原,1：5000倍稀释的HRP标记的抗人IgG为检测抗体；应用建立的间接ELISA检测120份健康体检人群血清,确定该方法的cutoff值(cutoff值=均数±3倍标准差)为0.574；以22例白念珠菌尿患者的血清为病例组,120例健康体检人群血清,4例热带念珠菌尿、1例克柔念珠菌尿、1例近平滑念珠菌尿患者血清为对照组,应用统计软件SPSS13.0计算分析,病例组血清中15例Csa2抗体检测阳性,检测的灵敏度为68.18%(15/22)；对照组中1例热带念珠菌尿患者血清阳性,1例近平滑念珠菌尿患者血清阳性,6份健康体检人群血清阳性。检测的特异度为93.65%(118/126),诊断阳性预测值65.22%(15/23)；阴性预测值为94.40%(118/125)。比较22份念珠菌尿患者血清采用双抗原夹心和间接ELISA检测结果,两种方法检测都为阳性的血清12例,两种方法检测都为阴性的血清5例,双抗原夹心ELISA检测阳性,间接ELISA检测阴性的标本2例,双抗原夹心ELISA检测阴性,间接ELISA检测阳性的标本3例。第二篇新型隐球菌Cpl1蛋白抗原、抗体检测ELISA方法的建立和评价1、新型隐球菌重组Cpl1蛋白表达与免疫血清制备通过系统发育分析(Phylogenetic analysis),寻找念珠菌属、曲霉菌属、青霉菌属和毛孢子菌属中与Cpl1蛋白同源的蛋白,发现只有新型隐球菌格鲁比变种和加蒂隐球菌具有同源蛋白；构建pPIC9K-CPL1重组表达载体,使用毕赤酵母表达系统(GS115)表达CPL1基因,得到重组Cp11(rCp11)蛋白,SDS-PAGE鉴定分子量约为18.6kDa。纯化rCpl1蛋白分别免疫新西兰大白兔和豚鼠,制备兔和豚鼠源性的多克隆抗体,纯化兔抗血清,测量纯化的兔多抗IgG浓度为20.25mg/mLo2、新型隐球菌特异性Cpl1蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立和评价采用RPMI1640、YPD、液体沙氏培养基和YPM-R4种培养基进行新型隐球菌荚膜培养,其中YPM-R培养上清中Cpl1蛋白表达量最高,留取培养18小时、40小时、64小时、88小时、112小时、148小时和160小时的培养上清,当培养112小时时,Cpl1蛋白表达量达到最高值。间接免疫荧光染色发现,rCpl1蛋白主要位于新型隐球菌荚膜表面,尤其在出芽部位显示高亮的绿色荧光。棋盘滴定法确定Cpl1双抗体夹心ELISA方法反应条件,以20ug/mL的纯化兔抗包被96孔板,1：500稀释的豚鼠抗体血清为捕获抗体,1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗豚鼠抗体为二抗。分别检测一系列已知浓度的rCpl1和倍比稀释的新型隐球菌、新型隐球菌格鲁比变种、加蒂隐球菌、阿氏丝孢酵母菌、白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉菌、土曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、构巢曲霉菌和马尔尼菲青霉菌培养上清,该方法检测rCpl1的最低浓度为240pg/mL,可检测最高64倍稀释的新型隐球菌培养上清中的Cpl1蛋白及32倍稀释新型隐球菌格鲁比变种,检测灵敏度较高；对其它真菌培养上清检测均为阴性,具有较高检测特异性。3、新型隐球菌特异性Cpl1蛋白双抗原夹心ELISA方法的建立和评价改良过碘酸钠法制备HRP标记的rCpl1蛋白(rCp11-HRP),棋盘滴定法确定Cpl1双抗原夹心ELISA方法的反应条件,以0.1ug/mL的rCpl1蛋白包被96孔板；检测一系列倍比稀释的rCpl1蛋白免疫的兔抗血清和正常兔血清、白念珠菌rCsa2蛋白免疫兔血清、烟曲霉菌rAfmp1p和rAfmp4p蛋白免疫兔血清、马尔尼菲青霉菌rMp1p蛋白免疫兔血清,rCp11-HRP1:1000倍稀释用于检测Cpl1抗体。该方法可检测最高稀释8000倍的rCpl1免疫兔抗血清,具有较高的检测灵敏度；并且与正常兔血清其余4种重组真菌蛋白免疫兔血清没有交叉反应,表明具有较高的检测特异性。小结通过上述两部分研究可得到如下结论：1、在毕赤酵母表达体系中成功表达了rCsa2蛋白。重组蛋白纯化后,分别免疫新西兰大白兔和豚鼠,制备兔源和鼠源多抗,经鉴定制备的多抗效价皆在百万以上。以纯化兔抗为包被抗体,豚鼠抗体血清为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法检测Csa2蛋白。该方法具有较高的检测灵敏性和特异性。2、成功制备了HRP标记的rCsa2。以rCsa2为包被抗原,rCsa2-HRP为检测抗原,建立了双抗原夹心ELISA检测Csa2抗体。该方法具有较高的检测灵敏性和特异性。以Csa2双抗原夹心ELISA检测结果为基础,成功建立Csa2间接ELISA。3、应用建立的Csa2抗原、抗体检测方法检测健康人血清标本,确定方法的cutoff值。应用三种方法检测白念珠菌尿和其它念珠菌尿患者血清,鉴于白念珠菌尿培养阳性可受到污染和定植的干扰,综合分析Csa2抗原、抗体检测结果,可对白念珠菌感染病情进展起到很好的提示作用：当Csa2抗原检测阳性,抗体检测阴性时,提示白念珠菌可能处于早期感染的致病状态；当Csa2抗原检测阴性,抗体检测阳性时,提示宿主可能曾出现白念珠菌感染,但已被机体清除；当Csa2抗原、抗体检测皆为阳性时,提示宿主可能处于持续白念珠菌致病状态,应密切关注感染的发展情况,防止进展为侵袭性念珠菌病；当Csa2抗原、抗体检测皆为阴性时,提示为白念珠菌的定植。4、证实Cpl1蛋白为新型隐球菌特异性的分泌蛋白。在毕赤酵母表达体系中成功表达了rCpl1蛋白并纯化。分别免疫新西兰大白兔和豚鼠,制备兔源和鼠源多抗,经鉴定制备的多抗效价皆在百万以上。以纯化兔抗为包被抗体,豚鼠抗体血清为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法检测Cpl1蛋白。该方法具有较高的检测灵敏性和特异性。5、成功制备了HRP标记的rCpl1。以rCpl1为包被抗原,rCpl1-HRP为检测抗原,建立了双抗原夹心ELISA检测Cpl1抗体。该方法具有较高的检测灵敏性和特异性。由于未能获得足够数量的侵袭性念珠菌病患者血清和新型隐球菌感染患者血清,因此所建立的免疫学检测方法对这两种疾病的诊断意义尚需进一步临床验证。