论文部分内容阅读
自从2010年底,猪流行性腹泻病毒（PEDV）导致的仔猪高致病率及高致死率为特征的猪流行性腹泻（PED）在我国多次暴发,引起人们对PED的高度关注度。研究表明,我国当前流行的PEDV毒株与疫苗株CV777相比在核苷酸及氨基酸水平上发生很大的变异。为了揭示当前PEDV流行株与疫苗株CV777在生物学特性、进化关系及抗原性等方面的差异,本论文开展了以下几个方面的研究:1.PEDV江西野毒株的分离、传代和鉴定:为了了解当前流行的PEDV毒株的生物学特性,我们从江西九江地区采集12份死于PED的仔猪肠道样品用于PEDV的分离。其中一株命名为CH/JX/01的阳性样品在添加10μg/mL胰酶的情况下盲传至第3代时导致Vero-81细胞产细胞病变,并且RT-PCR鉴定为PEDV阳性。目前,江西株CH/JX/01已经在Vero细胞中稳定传了超过60代,其滴度达到2.7×106 PFU/mL或5.12lg TCID50/mL,比CV777疫苗株复制速度快,后者滴度仅为5.86×104PFU/mL或4.6 lg TCID50/mL。但是,PEDV江西株CH/JX/01在Vero细胞中形成的蚀斑比CV777疫苗株的蚀斑要小。通过qRT-PCR,我们发现随着CH/JX/01不断适应Vero细胞,江西株CH/JX/01前2代的RNA滴度在6-7 lg RNA拷贝/μL,第3-20代的RNA滴度都在7 lg RNA拷贝/μL以上。2.PEDV江西株CH/JX/01与CV777疫苗株生长特性比较:本研究测定和比较了江西株CH/JX/01与CV777疫苗株在Vero细胞内的复制动态变化。结果表明细胞接种病毒6h后,江西株CH/JX/01开始诱导细胞形成病变,病变特征是单个细胞失去界限,融合周围的细胞形成包含大量细胞核的合胞体,之后,细胞上清液中病毒滴度逐渐升高,到27 hpi时,病毒滴度到达峰值;CV777疫苗株在接种到Vero细胞8h后,细胞上清液中病毒滴度才开始上升,到31 hpi,病毒滴度到达峰值,但△Ct的峰值比江西株CH/JX/01要更低（11.34比15.30）。3.PEDV江西株CH/JX/01传代株全基因组测序和比较分析:本研究成功克隆和测定了CH/JX/01父母代（CH/JX/01/P0）、第5代（CH/JX/01/P5）及第30代（CH/JX/01/P30）的全基因组序列,基因组除去poly A尾,长度均为28,038bp,没有发生碱基的插入或者缺失现象,但不同代次毒株间存在替代突变。基因组结构与疫苗株CV777类似,为5’UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。测序结果表明随着江西株CH/JX/01代数增加,整个基因组的碱基突变数也逐渐增大,突变位置主要位于ORF1a/1b、S、E及M基因。CH/JX/01/P30与CH/JX/01/P0相比,ORF1a/1b、S、E及M基因分别存在10、7、1及1个碱基的突变,并导致其对应的基因编码区6、7、1及1个氨基酸的突变。为了揭示PEDV致弱的分子机制,本试验将CH/JX/01/P0、CH/JX/01/P5,CH/JX/01/P30传代株与CV777（AF353511）、attenuated CV777（KT323979）,virulent DR13（JQ023161）及attenuated DR13（JQ023162）进行比较分析。结果表明PEDV弱毒株（attenuated CV777和attenuated DR13）在nsp3的Ac区及ORF3区域分别有24及49个核苷酸的缺失。之后,我们对PEDV弱毒株及毒力株Ac及ORF3基因的RNA二级结构及蛋白三维结构预测和比较分析。结果表明DR13（JQ023161）与attenuated DR13（JQ023162）的Ac基因RNA二级结构相似,但CV777（AF353511）,attenuated CV777（KT323979）及CH/JX/01/P0（KX058031）之间的RNA二级结构差异很大。PEDV强毒株的Ac蛋白三维结构比弱毒株内部多了2个β折叠结构,但整体蛋白结构相似。PEDV弱毒株（attenuated DR13和attenuated CV777）之间的ORF3基因RNA二级拓扑结构比较相近,但与毒力株相差很远,而且毒力株之间各不相同。PEDV毒力株与弱毒株之间ORF3蛋白高级结构相差非常大,毒力株比弱毒株多了2个α螺旋,2个β折叠和大量的无规则卷曲结构。通过对CH/JX/01/P0,CH/JX/01/P5及CH/JX/01/P30的全基因组、S、S1、S2、ORF3、E、M及N基因的系统遗传进化分析,我们发现CH/JX/01这三代都属于G2群中的2a亚群。除了ORF3基因遗传进化树外,疫苗株CV777都属于G1群当中的1a亚群。根据全基因组序列进化关系,CH/JX/01与河南省当前流行的PEDV毒株CH/ZMDZY/11（KC196276）、CH/HNYF/14（KP890336）及CH/HNQX-3/14（KR095279）亲缘关系最近。基于S全基因序列的系统进化关系拓扑结构与PEDV全基因组进化关系的相似,CH/JX/01也是与河南流行毒株CH/ZMDZY/11（KC196276）最为相近。S1基因系统遗传进化分析表明CH/JX/01毒株与CH/FJND-3/2011（JQ282909）亲缘关系较为接近,而S2、E、及M基因遗传进化树的拓扑学结构比较相似。基于S2、E及M基因构建的进化树表明本研究分离的CH/JX/01毒株与美国、韩国当前流行的毒株及我国2010年之后分离的毒株进化关系比较接近。ORF3基因进化关系表明江西株CH/JX/01与美国及韩国当前流行的PEDV毒株相近,值得关注的是在ORF3基因区域,CV777疫苗株坐落在1b亚群。N基因的系统遗传进化关系表明CH/JX/01与2013年江西分离株CH/JX-1/2013（KF760557）相近。为了确定本试验分离株CH/JX/01是否发生重组,我们通过RDP4软件对江西株CH/JX/01做了重组分析。重组分析结果表明RDP、GENECOVN、Bootscan、MaxChi、Chimaera、Siscan和3Seq等七种算法预测均显示重组信号。江西株CH/JX/01很可能来源于河南省CH/HNYF/14（KP890336）及江苏省JS-HZ2012（KC201147）株的重组。CH/JX/01的ORF1b区域可能来源于CH/HNYF/14（KP890336）相似的毒株,而结构基因及ORF3基因区域主要来自于JS-HZ2012（KC201147）株相似的毒株。4.PEDV江西分离株CH/JX/01病毒交叉保护试验:为了揭示江西当前流行的PEDV毒株与疫苗参考株在抗原性上的差异,本试验对江西株CH/JX/01与疫苗参考株进行了交叉中和反应试验。病毒中和试验表明兔抗CH/JX/01毒株的血清能够完全中和CH/JX/01病毒,兔抗CV777的血清也能够完全中和CV777病毒,但是兔抗CH/JX/01毒株抗血清不能够中和CV777病毒,反之亦然。