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研究背景糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见严重并发症之一,常发展成为终末期肾病(ESRD)。目前,临床治疗手段主要是控制血糖和抗高血压,但疗效有限,只能减慢糖尿病肾病向肾功能衰竭的进程。因此,必须针对糖尿病肾病的主要病理机制研发新的治疗药物。糖尿病肾病组织学损伤的主要特征是胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质(ECM)成分在肾小球系膜和肾小管间质进行性沉积,最终导致不可逆的肾纤维化。近年来,不少研究着力于寻找能有效抑制ECM在组织中沉积而治疗糖尿病肾病的药物,取得了一些前景诱人的成果。AKF-PD是一种新合成的低分子量化合物。我们研究组最近报道,在体外培养的小鼠肾小球系膜细胞和大鼠肾小管上皮细胞中,AKF-PD能够抑制转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)刺激后引起的ECM的产生。目的以糖尿病肾病db/db小鼠和MES13肾小球系膜细胞为实验对象,观察AKF-PD对肾纤维化的治疗效果,并深入揭示其作用机制,为研发治疗糖尿病肾病的抗纤维化新药提供实验证据。方法1.10周龄雄性db/db小鼠分为1个不给药模型组和3个AKF-PD给药组(剂量分别为每日125、500、1000mg/kg体重)；相同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组。称体重和测血糖后,AKF-PD溶于羧甲基纤维素钠溶液作灌胃给药,不给药db/db组和db/m组小鼠作等量羧甲基纤维素钠溶液灌胃,各组小鼠每天灌胃一次,持续12周。实验期间2周一次测血糖水平。实验12周后,小鼠分单只置于代谢笼,收集24h尿标本。用ELISA法测定尿白蛋白浓度。处死各组小鼠。称体重后,取双侧肾脏,称肾重和剪取肾皮质。制备肾皮质组织切片,作PAS染色。光镜下观察组织切片,按每只小鼠20个肾小球,分5级(0-4级)进行每个肾小球损伤程度的评分,并计算肾小球系膜基质扩展指数(GMI)。用ELISA法测定肾皮质组织匀浆TGF-β1蛋白水平。以β-actin为内参作标化,real-time PCR方法检测肾皮质组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白(FN)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、α-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)mRNA的相对丰度。用肾皮质组织裂解产物作SDS-PAGE,进行western blot检测。以a-tublin为内参标化,检测TIMP-1、α-SMA蛋白质的相对含量。2.细胞周期同步化处理的小鼠肾小球系膜细胞系(MES-13)细胞分为6个组：(1)NG组(正常浓度葡萄糖,,-5.6mmol/L);(2)HG组(高浓度葡萄糖,25mmol/L);(3) AKF-PD组(HG+400μg/mLAKF-PD);(4)PFD组(HG+400μg/mL吡非尼酮)；(5)Los组(HG+21μmol/L氯沙坦)；(6)OC组(渗透压对照组,NG+19.4mmol/L甘露醇)。各组细胞培养72h后,收集细胞和上清。用ELISA法测定细胞培养上清液的TGF-β1蛋白水平。以β-actin为内参,real-timePCR方法检测细胞Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TIMP-1、α-SMA mRNA的相对丰度。用细胞裂解产物作SDS-PAGE,进行western blot检测。以a-tublin为内参,检测TIMP-1、α-SMA蛋白质的相对含量。结果dbldb组小鼠的肾重明显大于db/m组小鼠(P<0.05)。与不给药组相比,AKF-PD给药组dbldb小鼠的肾重明显减轻(P<0.05),以500mg/kg剂量组效果最明显(P<0.01)。dbldb小鼠有严重的白蛋白尿,24h尿白蛋白排泄量达240.26±76.24μg,比db/m小鼠组升高8倍(P<0.01)。AKF-PD给药显著减轻dbldb小鼠的白蛋白尿(P<0.01),最大有效剂量为500mg/kg,可使24h尿白蛋白排泄量下降58.5%。从实验开始至实验结束,dbldb小鼠始终有严重的高血糖,血糖一般维持于30mmol/L以上。AKF-PD给药组与不给药组dbldb小鼠的血糖水平差异无显著性意义。与db/m小鼠相比,dbldb小鼠的肾小球系膜基质PAS阳性染色区明显扩大,肾小球系膜基质扩展指数(GMI)显著增加(P<0.01)。与不给药组dbldb小鼠比,AKF-PD给药组dbldb小鼠的肾小球系膜基质PAS阳性染色区明显缩小,GMI显著减低(P<0.05),其中,500mg/kg体重剂量组的GMI值减低约55.8%(P<0.01)。dbldb小鼠肾皮质的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的mRNA表达水平比db/m小鼠显著升高(P<0.01)。AKF-PD显著抑制三种细胞外基质成分mRNA的表达(P<0.05)dbldb小鼠肾皮质的TGF-β1mRNA和蛋白表达水平比db/m小鼠显著升高(P<0.01)。AKF-PD显著抑制dbldb小鼠肾皮质TGF-β1的表达(P<0.05)。dbldb小鼠肾皮质TIMP-1mRNA和蛋白表达水平显著高于db/m小鼠(P<0.01)。AKF-PD给药对dbldb小鼠肾皮质TIMP-1的高表达具有显著下调作用(P<0.01)。dbldb小鼠肾皮质α-SMA mRNA和蛋白的表达水平显著高于db/m小鼠(P<0.01)。AKF-PD给药明显抑制dbldb小鼠肾皮质α-SMA的表达(P<0.05),其最大有效剂量为500mg/kg。与NG组相比,HG组MES-13细胞的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原mRNA表达水平显著增高(P<0.01)。与HG组相比,AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。且三种药物的作用相似。与NG组相比,HG组MES-13细胞的TGF-β1mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01)；与HG组相比,AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的TGF-β1mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。而AKF-PD与PFD能使TGF-β1蛋白表达下调到接近NG组的水平,氯沙坦的这种作用较弱。与NG组相比,HG组MES-13细胞的TIMP-1mRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.01)；与HG组相比,AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的TIMP-1mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。且三种药物的作用相似。与NG组相比,HG组MES-13细胞的α-SMA蛋白表达水平显著增高(P<0.01)；与HG组相比,AKF-PD组、PFD组与氯沙坦组MES-13细胞的α-SMA蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。且三种药物的作用相似。结论：AKF-PD长期给药对db/db小鼠的糖尿病肾病有治疗作用,可显著减少糖尿病肾病db/db小鼠24小时尿白蛋白排泄量,减轻肾小球系膜基质扩展,抑制肾组织Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白等细胞外基质成分及TGF-β1、α-SMA、TIMP-1的表达。AKF-PD对db/db小鼠的高血糖无明显影响。AKF-PD能明显抑制高糖刺激下小鼠肾小球系膜细胞(MES-13)的Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、TGF-β1、α-SMA、TIMP-1表达。AKF-PD治疗糖尿病肾病肾纤维化的作用机制与其抑制肾小球系膜细胞TGF-β1的产生,抑制肾小球系膜细胞向肌成纤维细胞表型的转分化,抑制细胞外基质降解调节分子TIMP-1表达,调节肾脏细胞外基质降解平衡有关。