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气道粘液过度分泌是慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、支气管扩张等慢性气道炎症性疾病发生、发展和死亡的常见原因,目前仍缺乏有效的治疗手段。粘蛋白MUC5AC是气道粘液的主要成分,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、表皮生长因子(Epthelia growth factor,EGF)、卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate,PMA)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)等均可刺激气道粘蛋白MUC5AC表达。铜绿假单胞菌是慢性气道炎症性疾病的常见致病菌,研究调控该菌壁致病原LPS诱导的气道粘蛋白MUC5AC高表达具有重要临床实践意义,将可能为降低慢性气道炎症性疾病的发病率、死亡率、缩短住院天数、降低住院费用提供新的治疗策略。白藜芦醇广泛存在于葡萄、藜芦、虎杖、花生等多种植物和食物中,是一种具有很强生物活性的植物多酚,是核因子相关因子2(Nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)的强诱导剂,具有抗炎、抗氧化、降血脂、防衰老、肿瘤预防等作用。曾有学者研究发现白藜芦醇可抑制EGF、PMA及TNF-α诱导NCI-H292细胞表达粘蛋白MUC5AC,但未阐述在体内是否具有同样效应,也未深入探索潜在机制。而且,对于白藜芦醇是否可抑制LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达及其作用机制,目前尚无研究报道。Nrf2是细胞抗氧化应激反应重要的转录因子之一。细胞外刺激因子,如氧化应激、细胞因子、炎症因子等,通过激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)信号通路,将细胞外信号传递到细胞核,激活Nrf2转录因子,参与调控细胞生长、分化、凋亡、炎症、肿瘤及抗氧化应激等过程。也有研究提示Nrf2介导的抗氧化应激反应在气道粘蛋白MUC5AC表达中发挥重要作用。因此,我们推测白藜芦醇通过MAPK/Nrf2通路发挥调控LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达的作用。目前国内外尚无研究报道白藜芦醇在LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达中的调控作用及机制,具有一定的创新性和临床意义。我们希望通过本研究明确白藜芦醇通过MAPK/Nrf2通路抑制LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达,为调控粘液过度分泌提供新的治疗策略。第一章白藜芦醇在脂多糖诱导NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达中的作用目的:观察白藜芦醇对LPS诱导NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达的调控作用。方法:1、不同浓度(2.5-20μg/ml)、不同时间(0-48h)LPS干预NCI-H292细胞后,采用Q-PCR及WB法分别检测MUC5AC的m RNA和蛋白表达;2、MTT比色法检测白藜芦醇对NCI-H292细胞活力的影响;3、检测白藜芦醇对LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达的影响:白藜芦醇预处理30min后予LPS干预24h,Q-PCR及WB法检测细胞MUC5AC及Nrf2的表达。结果:1、LPS诱导NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达呈时间依赖性,但非浓度依赖性,10μg/ml干预24小时效果最佳,MUC5AC m RNA及蛋白相对表达量分别为7.169±1.785和2.340±0.209,与空白对照组相比p<0.05。2、MTT比色法显示10μM-70μM白藜芦醇联合LPS干预NCI-H292细胞24小时,无明显毒性,细胞存活率达90%以上;3、白藜芦醇抑制LPS诱导NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达,以50μM浓度最佳,MUC5AC m RNA和蛋白表达量分别为0.533±0.122、1.151±0.378,低于LPS干预组(p<0.05);4、白藜芦醇可诱导NCI-H292细胞转录因子Nrf2表达。随着白藜芦醇干预浓度增加,Nrf2表达量逐渐增加,以50μM为著,Nrf2 m RNA和蛋白表达量分别为2.277±0.693和2.215±0.341。结论:白藜芦醇抑制LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达,增加转录因子Nrf2表达。第二章转录因子Nrf2在白藜芦醇调控NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达中的作用目的:通过检测细胞内ROS产量并使用si RNA干扰NCI-H292细胞Nrf2基因表达,研究转录因子Nrf2在白藜芦醇调控LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达中的作用。方法:1、流式细胞仪检测分析白藜芦醇对LPS诱导NCI-H292细胞产生ROS的影响;2、Nrf2 si RNA干扰Nrf2基因表达对白藜芦醇调控LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达的影响:白藜芦醇分别预孵育Nrf2 si RNA转染的NCI-H292细胞和正常细胞30min后,加入10μg/ml LPS干预24h,检测细胞MUC5AC m RNA及蛋白表达。结果:1、白藜芦醇抑制LPS诱导NCI-H292细胞产生ROS;2、第3对Nrf2 si RNA有效抑制Nrf2的表达,以100n M转染浓度干扰效果最佳,Nrf2 m RNA表达降低71.7%,蛋白表达降低58.2%;3、Nrf2 si RNA干扰Nrf2表达后,白藜芦醇抑制LPS诱导NCI-H292细胞MUC5AC表达的作用被阻断。RES+LPS+Nrf2 si RNA组MUC5AC m RNA及蛋白表达量分别为2.384±0.492和1.655±0.166,高于RES+LPS组的0.954±0.418和1.006±0.194(p<0.05)。结论:白藜芦醇通过激活Nrf2抑制LPS诱导NCI-H292细胞产生ROS和表达MUC5AC。第三章MAPK通路在白藜芦醇调控脂多糖诱导NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达中的作用目的:探索MAPK通路对白藜芦醇调控LPS诱导粘蛋白MUC5AC表达的影响。方法:1、MAPK阻断剂对白藜芦醇抑制LPS诱导NCI-H292细胞MUC5AC表达的影响:MAPK阻断剂预处理60min后,用50μM白藜芦醇干预30min,最后加入10μg/ml LPS作用24h,Q-PCR和WB法检测细胞MUC5AC的表达;2、白藜芦醇对NCI-H292细胞ERK1/2和p38 MAPK磷酸化的影响:50μM白藜芦醇预孵育细胞30min后,加入10μg/ml LPS干预24小时,WB法检测细胞ERK1/2和p38 MAPK磷酸化蛋白的表达量。结果:1、PD98059和SB203580可阻断白藜芦醇抑制LPS诱导NCI-H292细胞MUC5AC表达的作用,而SP600125无此作用。PD+RES+LPS和SB+RES+LPS干预组MUC5AC m RNA及蛋白表达量均高于RES+LPS干预组,而SP+RES+LPS干预组MUC5AC表达仍处于低水平。2、PD98059和SB203580可阻断白藜芦醇上调NCI-H292细胞Nrf2表达。3、白藜芦醇可激活NCI-H292细胞ERK1/2、p38 MAPK发生磷酸化。与空白对照组相比,RES+LPS干预组p ERK1/2及pp38 MAPK蛋白表达量均增加(p<0.05)。结论:白藜芦醇通过激活ERK1/2和p38 MAPK发挥抑制LPS诱导NCI-H292细胞粘蛋白MUC5AC表达的作用。第四章白藜芦醇在脂多糖诱导小鼠气道炎症及粘蛋白MUC5AC表达中的调控作用目的:气道滴注LPS法建立小鼠肺组织粘蛋白MUC5AC急性高表达模型,探索白藜芦醇在调控小鼠气道炎症及肺组织粘蛋白MUC5AC表达中的作用及机制。方法:8-12周龄C57BL/6小鼠随机分为对照组、LPS模型组和白藜芦醇干预组。对照组气道滴注PBS(50μl),LPS模型组气道滴注100μg/50μl LPS,白藜芦醇干预组在气道滴注LPS前1小时行腹腔注射RES(30mg/kg)。观察小鼠一般情况,第7天处死,获取小鼠肺泡灌洗液行细胞总数及中性粒细胞数计数、肺组织HE染色,了解肺部炎症情况;行肺组织PAS染色、Q-PCR方法和WB法分别检测小鼠肺组织MUC5AC及Nrf2的m RNA和蛋白表达;WB法检测ERK1/2和p38MAPK磷酸化情况。结果:1、成功建立LPS诱导的小鼠肺组织粘蛋白MUC5AC急性高表达模型。LPS气道滴注后第7天,小鼠肺泡灌洗液细胞总数和中性粒细胞数显著增加;HE染色见肺泡腔部分消失,肺泡壁增厚和大量炎症细胞浸润,肺间质充血、水肿,气道上皮增生、水肿、变形;PAS染色见小鼠肺组织粉红色区域较PBS组显著增多;小鼠肺组织MUC5AC表达增高;2、白藜芦醇减轻LPS诱导的小鼠肺组织炎症。RES+LPS干预组小鼠肺泡灌洗液细胞总数和中性粒细胞数分别为180±22.068和134.667±16.563,低于LPS模型组的334±24.269和246.667±20.207,p<0.01;HE染色镜下见肺泡腔破坏减轻,肺泡壁厚度较薄,肺泡腔内及周围浸润的炎症细胞明显减少,肺间质充血、水肿以及气道上皮增生、水肿、变形均有所改善;3、白藜芦醇抑制LPS诱导小鼠肺组织粘液表达。PAS染色见RES+LPS干预组小鼠肺组织粉红色区域较LPS模型组减少;小鼠肺组织MUC5AC m RNA和蛋白表达量为1.295±0.677和1.212±0.058,低于LPS模型组5.429±2.267和3.694±0.993,p<0.05。4、白藜芦醇上调小鼠肺组织Nrf2表达,Nrf2 m RNA和蛋白表达量为2.365±0.400和2.785±0.278,高于LPS模型组1.033±0.268和1.15±0.157,p<0.05;5、白藜芦醇可以增加小鼠ERK1/2蛋白磷酸化,但是p38 MAPK磷酸化不明显。结论:1、气道滴注LPS可成功构建C57BL/6小鼠肺组织粘蛋白MUC5AC急性高表达及气道炎症模型;2、白藜芦醇可能通过激活ERK/Nrf2通路参与抑制LPS诱导小鼠气道炎症和粘蛋白MUC5AC表达。