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一、目的构建能够在真核细胞中良好表达外源基因的重组人热休克蛋白70(Hsp70)基因腺病毒载体,为进一步研究恶性肿瘤的基因治疗提供基础。二、方法PCR法从质粒pOTB7/Hsp70中扩增目的基因Hsp70,酶切电泳测序等鉴定扩增产物正确后,与酶切线性化的穿梭质粒pDC315-EGFP连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,鉴定阳性克隆得到重组穿梭质粒pDC315-EGFP-Hsp70。鉴定重组穿梭质粒外源基因表达良好后与腺病毒骨架质粒AdMax采用脂质体法转染人胚肾293细胞,在细胞内重组、包装产生重组腺病毒Ad-Hsp70,并鉴定外源基因的表达。三、结果质粒pOTB7/Hsp70的PCR产物经酶切电泳等鉴定为目的基因Hsp70,测序结果与Genebank中报道的基因序列相似度达99%,有三处同义突变。目的基因扩增产物与线性化质粒pDC315-EGFP连接后转化感受态细胞DH5a,提取质粒得到重组质粒pDC315-EGFP-Hsp70,经琼脂糖凝胶电泳证实阳性克隆中外源基因Hsp70插入方向正确,测序结果与Genebank中报道的基因序列相似度达99%,有三处同义突变。重组穿梭质粒脂质体法转染HEK293细胞48h后,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,western blot法检测Hsp70有效表达。重组穿梭质粒pDC315-EGFP-Hsp70与腺病毒骨架质粒用脂质体法转染HEK293细胞,在HEK293细胞中重组包装成重组腺病毒Ad-Hsp70。在转染后第2天可见绿色荧光蛋白表达,第9天见明显的CPE现象。收获病毒,再次转染HEK293细胞,48h后观测到绿色荧光蛋白表达,western blot检测Hsp70蛋白在真核细胞中有效表达,证明重组腺病毒重组包装正确。重组腺病毒Ad-Hsp70滴度为1011pfu/ml。四、结论成功构建的重组穿梭质粒pDC315-EGFP-Hsp70与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞后,重组包装出可有效表达外源基因Hsp70基因的重组腺病毒Ad-Hsp70,为某些恶性肿瘤的基因治疗奠定了基础。