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研究背景:
先天性以及后天性尿道缺损、尿道损伤等尿道疾患的治疗一直是泌尿外科的难题。文献报道手术方法300余种。许多组织已被尝试用于尿道缺损的修补,其中包括动脉、静脉、阑尾、阴囊皮肤,颊黏膜、口腔黏膜、膀胱黏膜、包皮、输尿管等等。但这些方法多以牺牲正常组织为代价,以手术创伤修复组织缺损,效果欠佳,并发症多。随着生命科学、材料科学以及相关学科的迅猛发展,诞生了一门新生交叉学科--组织工程学,它为泌尿系组织或器官的重建开辟了新的途径。在泌尿系组织工程的研究中,支架材料对再造工程化组织具有重要作用。脱细胞基质作为支架材料越来越受到重视。脱细胞基质是指位于上皮或内皮细胞下层,结缔组织细胞周围,为组织、器官甚至整个机体提供力学支持和物理强度的物质。深入研究表明,脱细胞基质不仅为组织和机体提供力学支架和生物支架作用,而且对所作用的细胞类型中基因表达方式、细胞的增殖、黏附、分化、发育、扩散、移行、定居、凋亡等表现都有极其深远的影响。在去除具有抗原性的细胞成分同时,保留其天然的脱细胞基质和生物学特性,使其在体内基本达到无免疫原性的状态,是这类材料能够应用于组织修复的理论基础。
同时这些材料的修复也存在不足之处,比如组织工程化材料血管化比较慢,而其血管化反应的快慢对尿道各层组织细胞向支架材料爬行速度起关键性的作用。如何找到一种加速组织工程化材料血管化的方法是目前亟待解决的问题。目前大量的动物实验研究和临床资料均表明,血管内皮祖细胞(EPC)能帮助改善机体缺血部位和损伤部位的血供。
血管内皮祖细胞(EPC)是血管内皮细胞的前体细胞,又称为成血管细胞或者血管母细胞(angioblast),是干细胞分化成熟过程中的一个细胞阶段。研究表明,在脐带静脉血、成体外周血和骨髓中的CD34+单个核细胞或CD133+单个核细胞离体培养均能分化为内皮样细胞,从而认定这些细胞即为原始的血管内皮祖细胞(EPC),进一步的研究发现人脐带血、外周血中的血管内皮祖细胞(EPC)均来自于骨髓。机体的损伤或缺血可以通过引起内源性VEGF的水平升高来动员骨髓中的血管内皮祖细胞(EPC)向靶组织归巢、分化,而且在向成熟血管内皮细胞(endothelial cell,EC)分化、参与靶组织的血管再生过程中对CD133的表达逐渐转弱甚至消失。
国内外尚未见到有关将人羊膜脱细胞基质联合血管内皮祖细胞(EPC)移植应用于尿道缺损修复方面的文献报道。
研究目的:
本实验旨在用人羊膜脱细胞基质修复兔尿道部分缺损模型,评估其可行性,以期寻找理想的尿道修复材料。同时联合应用血管内皮祖细胞观察尿道的再生及血管化周期,寻求一种加速组织工程材料血管化的方法。
研究方法:
无菌取兔双下肢骨髓,应用密度梯度离心法分离并在体外培养其中单个核细胞层细胞,诱导其向血管内皮祖细胞(EPC)方向分化,将细胞传至第3代后备用。
取健康孕妇剖宫产羊膜组织,制成人羊膜脱细胞基质。36只雄性兔随机分成四组,均去除中段尿道1cm,制作成人工尿道缺损模型。实验组A(9只),单纯应用人羊膜脱细胞基质修复尿道缺损；实验组B(9只),应用种植血管内皮祖细胞的人羊膜脱细胞基质修复尿道缺损；实验组C(9只),应用种植空白细胞培养液的人羊膜脱细胞基质修复尿道缺损；对照组D(9只),将尿道缺损部分单纯行端端吻合。四组受试对象均置8号硅胶管做支架及导尿。术后1周每只兔每天应用青霉素80万单位肌注预防感染,同时对术区用络合碘消毒2次。若无特殊情况术后10天拔除支架管。分别于术后4周,12周,16周分三批取各实验组及对照组的尿道组织,观察大体标本及组织学的变化。随机计数100倍光镜下20个视野内毛细血管断面的数目,应用SPSS10.0统计学软件进行数据处理,比较实验组与对照组间的差异有无统计学意义。
研究结果:
1.人羊膜脱细胞基质:大体观察无色透明,有一定的弹性及韧性,倒置显微镜下观察呈网状结构。
2.兔骨髓源单个核细胞在体外呈贴壁生长,48 h内即贴壁牢靠。前4 d内生长较慢,近乎静止状态,4 d后生长明显加速,呈现出克隆样生长；10 d后细胞基本长满瓶底,表现出典型的铺路石样改变；经VEGF和bFGF在体外联合诱导培养后,细胞表现出条索状和草束状的排列方式。细胞免疫化学染色显示,目标细胞对CD133的表达水平下调,由具有CD34+/CDl33+/CD31+表型的细胞群逐渐分化成具有CD34+/CDl33-/CD31+表面特征的细胞群；
3.所有受试对象无死亡。实验组A及实验组C中各有一例术后第7天出现切口感染,经消毒、抗生素应用等措施处理后,感染控制,出现漏尿；其余各例均顺利恢复。
4.术后4周,各实验组受试对象尿道组织大体观察显示吻合口处已经基本无法辨认,尿道恢复连续性,欠光滑,组织学检查显示尿道内皮细胞已覆盖移植区,并可见新生血管,对照组大体观与组织学检查均呈正常尿道组织结构,局部可见瘢痕形成。新生毛细血管计数显示实验组B和实验组C的数据对比分别是4.40±0.82和1.30±0.66.(P2<0.01)。
5.术后12周,各实验组受试对象尿道组织大体观呈均匀一致,连续光滑完整的尿道,相比对照组不易分辨,组织学检查显示新生尿道上皮细胞排列趋于稳定、规则,并可见散在尿道平滑肌细胞生成,较对照组数量少、排列紊乱。新生毛细血管计数显示实验组B和实验组C的数据对比分别是6.55±0.76和2.50±0.83(P<0.01)。
6.术后16周,各实验组受试对象尿道组织大体观与对照组无明显差异,组织学检查实验组尿道组织层次与对照组无显著性差异,平滑肌数量上接近对照组,但排列稍欠规则。新生毛细血管计数显示实验组B和实验组C的数据对比分别是10.30±1.95和5.50±1.36(P<0.01)。
研究结论:
1.兔骨髓源单个核细胞在体外能诱导分化成血管内皮祖细胞(EPC)；
2.血管内皮祖细胞(EPC)在改善尿道缺损修复术后新尿道血液循环方面效果明显；
3.人羊膜脱细胞基质可以修复兔尿道部分缺损；
4.联合应用血管内皮祖细胞的人羊膜脱细胞基质可以成为修复尿道缺损的新型组织工程材料。