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短季棉(Short Season Cotton)是我国重要的棉花品种资源,在解决我国人多地少、粮棉争地矛盾、优化农业结构方面起着十分重要的作用,特别是在国家确保粮食安全的发展形式下,短季棉种植规模将有扩大的可能。借助农业生物育种技术和传统育种相结合,引进和利用新的丰产优质棉花种质资源,进一步改善现有短季棉品种的早熟性,协调早熟与高产、早熟与优质的矛盾,提高短季棉生产力,是目前及以后短季棉育种及生产发展的主要方向。中棉所36是陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中的一个短季棉品种,生育期107天。本研究以中棉所36作为材料,利用拟南芥Affymetrix全基因组芯片分析中棉所36一片真叶展平时和两片真叶展平时主茎生长点基因表达谱,筛选并克隆了3个与花芽分化相关的基因,并进行时空表达模式分析和转基因功能验证,获得部分早熟转基因植株,对促进棉花花发育进程,加快棉花早熟性状的遗传改良具有重要的理论意义和应用价值。取得的实验结果和主要结论如下:1.通过对早熟品种中棉所36和晚熟品种TM-1主茎生长点进行镜检,结果发现中棉所36在两片真叶展平时开始花芽分化,而TM-1在三片真叶展平时开始花芽分化。说明早熟品种花芽分化时间早于晚熟品种。2.利用拟南芥Affymetrix全基因组芯片分析中棉所36一片真叶展平时和两片真叶展平时主茎生长点基因表达谱,在22,700个转录本中筛选到360个差异表达显著的转录本,其中210个上调表达,155个下调表达。3.利用MIPS数据库对365个差异表达的基因进行了功能分类,主要包括转录因子、假定调节蛋白等,还有99个未知功能的或者新的基因。并将365个差异表达的拟南芥探针在http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=cotton网站进行了blastn分析。4.在360个差异表达显著的拟南芥探针所对应的棉花EST中挑选10个进行RT-PCR分析,结果发现RT-PCR结果与芯片数据分析结果完全一致。在10个差异表达的转录本中又挑选2个进行QRT-PCR分析,结果表明RT-PCR、QRT-PCR与芯片分析结果完全一致,说明利用拟南芥的全基因组芯片分析棉花花芽分化过程基因表达变化是完全可行的。5.其中在155个下调表达的转录本中筛选到一个与拟南芥VRN1基因同源性较高的转录本,对其进行不同部位QRT-PCR分析发现,在主茎生长点、根、花瓣、雄蕊、胚珠中都有表达,尤其在主茎生长点中优势表达;对其进行了主茎生长点不同时期QRT-PCR分析,结果发现在第一片真叶展平时高调表达,而在两片真叶展平时(花芽分化期)表达量有所下降,推测它可能与主茎生长点花芽分化过程有关。本实验克隆了其全长,在NCBI网站注册GU929695,并命名为GhV1基因。6.本研究利用本实验室构建的中棉所36全长均一化cDNA文库,筛选到GhCO,GhTM6两个与花发育相关基因,并利用QRT-PCR技术对不同部位不同发育时期的表达模式进行了分析。结果表明,GhCO基因在花、茎等部位中高调表达,GhTM6基因在花、雄蕊、雌蕊等部位高调表达。推测它们可能也参与了花发育过程。7.通过对GhV1、GhCO、GhTM6不同光照、温度下QRT-PCR分析,发现GhV1、GhCO、GhTM6三个基因在0 h时表达量很低,经过12h低温处理后表达量骤然上升,36h之后表达量又逐渐下降。GhV1基因在长日照(16 h light/8 h dark)、短日照(8 h light/16 h dark)和中日照(10 h light/14 h dark)条件下呈现出节奏性的变化。GhTM6和GhCO基因在短日照处理条件下,对日照的反应不敏感。8.利用农杆菌介导和花粉管注射方法对GhV1、GhCO、GhTM6三个基因进行了烟草和棉花的遗传转化。结果发现,外源GhV1基因的表达引起了烟草雄蕊的变化,转基因植株雄蕊三个长的,两个短雄蕊,且开花时间比野生型烟草也有提前。GhCO基因转基因植株出现4个花瓣,4个雄蕊的变异现象,且野生型的植株在19片叶子时开花,而转基因植株在14片叶子时开花。另外,外源的GhCO基因的表达引起了转基因植株的矮化。GhTM6转基因植株出现了6个花瓣和6个雄蕊的变异现象,且野生型的植株在19片叶子时开花,而转基因植株在18片叶子的时候开花。外源的GhTM6基因的表达引起了转基因植株节间变长,株高增加。通过农杆菌介导和花粉管注射方法已获得了GhCO、GhTM6、GhV1基因的棉花转基因植株,结果正有待进一步观察。