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研究背景和目的:胃癌是常见恶性肿瘤之一,近几年其发病率呈下降趋势,但在癌症相关的死亡统计中,其死亡率仍居高不下。血管生成拟态(Vasculogenic mimicry)VM是一种全新的肿瘤微循环供给模式,它与肿瘤的侵袭、转移和患者较差的生存预后密切相关。已有研究报道在多种恶性肿瘤中存在VM,如乳腺癌、肝癌、结肠癌等,但VM在胃癌中的报道却很少见。本研究的主要目的是研究胃癌中是否存在VM,并分析VM与临床病理参数的关系,并进一步探Cyclooxygenase-2参与胃癌VM形成的可能性及相关机制。研究方法:1)通过CD31/PAS双染实验标记VM,并分析VM与胃癌患者病理资料、生存预后的关系。2)免疫组化染色实验检测胃癌标本COX-2、PGE2、Snail的表达情况,分析COX-2与临床病理资料、生存预后的关系,并探讨COX-2、PGE2、Snail与VM存在的关系及COX-2与PGE2、Snail表达的相关性。3)根据COX-2的表达情况,选择低表达COX-2的MKN74胃癌细胞系和高表达COX-2的MKN45胃癌细胞系。对MKN74细胞构建COX-2上调模型,对MKN45细胞构建COX-2下调模型。利用Western-Blotting及RT-PCR鉴定COX-2转染效果。4)通过体外三维培养实验分析COX-2过表达对胃癌细胞系MKN74细胞形成VM管状结构能力的影响;COX-2降表达对MKN45细胞形成VM管状结构能力的影响;并检测VE-Cadherin的变化。5)细胞划痕和Transwell实验检测COX-2表达的变化对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。6)Western Blotting检测过表达COX-2对MKN74细胞PGE2、Snail、EMT相关蛋白(E-Cadherin、Vimentin)表达的影响;降表达COX-2对MKN45细胞中PGE2、Snail、EMT相关蛋白(E-Cadherin、Vimentin)表达的影响。7)对MKN74细胞构建Snail上调模型,对MKN45细胞构建Snail下调模型。利用Western Blotting检测转染效果。Western Blotting检测过表达Snail对MKN74细胞中EMT相关蛋白(E-Cadherin、Vimentin)表达的影响;降表达Snail对MKN45细胞中EMT相关蛋白(E-Cadherin、Vimentin)表达的影响。8)通过体外三维培养实验分析Snail过表达对MKN74细胞形成VM管状结构能力的影响;Snail降表达对MKN45细胞形成VM管状结构能力的影响。9)细胞划痕和Transwell实验检测Snail的变化对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响。结果:1)通过CD31/PAS染色证实胃癌中存在VM,100例胃癌组织中有35例存在VM结构,(35/100,35%)。VM的存在与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期无关(p=0.284;p=0.946;p=0.850;p=0.232),VM的存在与胃癌患者的Lauren,s分型、淋巴结转移和远处转移相关,差异具有统计学意义(p=0.029;p=0.020;p=0.018)。单因素生存分析表明,有VM组平均生存期为54.9个月,无VM组平均生存期为25.7个月,同一生存率下,有VM组比无VM组生存期短,差异具有统计学意义(p=0.001)。2)胃癌中COX-2的表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、Lauren,s分型、TNM分期未见明显差别(p=0.191;p=0.480;p=0.368;p=0.462;p=0.514),但COX-2的阳性表达与患者的淋巴结转移相关,差异具有统计学意义(p=0.025);有远处转移组COX-2的阳性率(75%,27/36)明显高于无远处转移组(53.2%,33/62),差异具有统计学意义(p=0.022)。Kaplan-Meier单因素生存曲线比较胃癌中COX-2阳性组与COX-2阴性组的生存率,结果表明COX-2阳性组平均生存时间为61.9个月,COX-2阴性组平均生存时间为31.9个月,COX-2阳性组比COX-2阴性组生存期短,差异具有统计学意义(p=0.002)。3)免疫组化实验结果显示,在胃癌中,有VM组COX-2、PGE2、Snail的阳性率均高于无VM组,差异具有统计学意义(p=0.032;p=0.013;p=0.012);Spearman相关分析表明,COX-2的表达与PGE2、Snail的表达呈正相关(p<0.05)。4)检测MKN74、MKN45两种胃癌细胞系,MKN74在mRNA和蛋白水平低表达COX-2,MKN45在m RNA和蛋白水平高表达COX-2。5)感染LV-COX-2慢病毒后,MKN74细胞的COX-2蛋白表达明显上调,感染LV-sh COX-2慢病毒后,MKN45细胞的COX-2蛋白表达明显下调。6)体外三维培养实验表明,过表达COX-2能够促进MKN74细胞管腔样结构的形成,沉默COX-2表达可抑制MKN45细胞管腔样结构的形成。上调COX-2表达可以上调MKN74细胞VE-Cadherin蛋白的表达,下调COX-2表达可抑制MKN45细胞VE-Cadherin的表达。7)MKN74细胞上调COX-2后,其迁移、侵袭能力明显增强;MKN45细胞下调COX-2后,其迁移、侵袭能力明显减弱。8)随着COX-2表达的变化,细胞表型出现相应的变化;WB结果表明,MKN74胞上调COX-2表达后,E-Cadherin蛋白表达的表达下调,Vimentin、Snail、PGE2的表达上调。MKN45细胞下调COX-2表达后,E-Cadherin表达上调,Vimentin、Snail、PGE2表达随之下调。9)MKN74细胞感染LV-Snail慢病毒后,其Snail表达明显上调;MKN45细胞感染LV-sh Snail慢病毒后,可以显著下调Snail的表达。10)WB结果表明,上调Snail可促进MKN74细胞EMT的发生,下调Snail可以抑制MKN45细胞EMT的发生。11)三维培养实验表明,上调Snail能够促进MKN74细胞管腔样结构的形成,下调Snail表达可抑制MKN45细胞管腔样结构的形成;MKN74上调Snail表达后,可以促进MKN74细胞的迁移和侵袭,下调Snail表达的MKN45胃癌细胞其迁移、侵袭能力明显减弱。结论:1)胃癌中存在VM这种微循环模式,VM的存在与胃癌患者的Lauren,s分型、淋巴结转移和远处转移相关,VM是评估胃癌患者预后的一个独立危险因素。2)在100例胃癌中有60例COX-2表达阳性;COX-2与其胃癌患者的淋巴结转移和远处转移相关,COX-2的阳性表达是评估胃癌患者预后的一个独立危险因素。3)上调Snail表达后,可诱导胃癌细胞EMT的发生,同时促进胃癌细胞VM的形成,并促进胃癌细胞的侵袭和迁移。4)COX-2可以通过诱导胃癌细胞发生EMT、上调VE-Cadherin的表达促进胃癌细胞VM的形成,并增强胃癌细胞的侵袭、迁移能力。