论文部分内容阅读
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）是人和多种动物的病原菌,该菌致病性是多种因素作用的结果,涉及外毒素、胞外蛋白酶等多种毒力因子,并且可能与Ⅲ型分泌系统（typeⅢsecretion system,TTSS）和密度感应机制（quorum sensing,QS）等调控系统密切相关。1.根据已发表的嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统（TTSS）的ascV基因保守区核苷酸序列设计合成一对引物,然后以J-1株的基因组为模板,通过PCR扩增得到331bp的保守基因片段,将目的片段进行测序。由于各菌株ascV基因的同源性较低,本研究分4段克隆J-1株的ascV基因并进一步拼接出该基因全长,同时PCR检测ascV基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。测序分析发现,扩增出的J-1株ascV全长基因与嗜水气单胞茵AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、86%、86%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为86%,与温和气单胞菌的同源性为87%。PCR检测结果表明:64株能扩增出ascV基因的目的片段,其中2株无毒菌株中也能扩增得到目的片段,而在2株有毒菌株中未能检测到,推测TTSS可能在嗜水气单胞茵某些菌株的致病机制上并不起关键作用。2.根据GenBank上登陆的嗜水气单胞菌AH-1株aopN基因序列设计一对含EcoRI和XhoI酶切位点的特异引物,然后以J-1株的基因组为模板,通过PCR扩增得到aopN基因,然后以EcoRI和XhDI将目的片段酶切,将片段连入酶切好的表达载体pET-32a（+）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。然后PCR检测aopN基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。测序分析发现,扩增出的片段长度为874bp,与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、81%、82%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为81%,与温和气单胞菌的同源性为82%。PCR检测结果表明,57株能扩增出aopN基因的目的片段。将重组原核表达质粒pET-aopN转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,获得分子量为54.5kDa的目的条带。用兔抗J-1株的血清进行的Western blot表明,该蛋白具有一定的免疫反应性。由于多数菌株都含有aopN基因,提示AopN可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。3.Ⅲ型分泌系统和密度感应系统在许多病原菌的致病过程中发挥作用。为探讨二者之间的关系,本试验首先运用高效检测菌株来检测嗜水气单胞菌J-1株和ahyR基因缺失突变株J-1△ahyR产生的自体诱导素的活性,检测结果显示,突变株的自体诱导素的分泌水平低于野生株,表明ahyR基因是密度感应系统重要的调节基因。在此基础上,运用实时荧光定量RT-PCR技术来检测嗜水气单胞菌J-1株和突变株J-1△ahyR中Ⅲ型分泌系统AopN蛋白的信使RNA（mRNA）的表达情况。从GenBank和第二章aopN基因测序结果中读取嗜水气单胞菌J-1株的16s rRNA基因和aopN基因的核苷酸序列,利用Primer5.0软件自行设计引物,提取细菌的总RNA,进行反转录,然后进行实时荧光定量PCR。经过软件分析,结果表明两对引物特异性非常好,突变株AopN蛋白mRNA的表达量是野生株的210倍。揭示密度感应系统的调节基因ahyR可能负调控Ⅲ型分泌系统蛋白的表达。本研究为全面研究密度感应系统和Ⅲ型分泌系统的关系奠定了基础。