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由毒素基因和抗毒素基因构成的毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin,Tasystem)广泛存在于细菌中。毒素基因编码相对稳定的毒素蛋白,具有细胞毒性作用,可抑制细胞生长或导致细胞死亡;抗毒素基因编码可被依赖ATP的蛋白酶降解的不稳定的抗毒素蛋白,与毒素蛋白相互作用形成复合体可抑制毒素的细胞毒性。毒素.抗毒素蛋白复合体可通过抗毒素蛋白结合于TA系统其启动子的调控序列,反馈调控TA系统的转录。大量存在于细菌染色体上的TA系统的生理功能尚不清楚,并存在多种推测。现有的研究结果显示,一些细菌染色体上的TA系统与细胞适应性胁迫反应有关,可能使细菌可以适应不同的胁迫环境。具有独特环境适应能力的蓝藻染色体上也具有大量的TA系统,如集胞藻PCC6803染色体上至少有30个TA系统,但其生理功能和生化遗传特征尚不清楚。此前,本实验室初步证明集胞藻PCC6803染色体上的基因对sll2733/sll1400和slr0770/slr0771构成两个TA系统,其中sll2733和slr0770为抗毒素基因,skk1400或slr0771为毒素基因。本文对这两对TA系统进行了如下研究:
1)在大肠杆菌中诱导sll2733/sll1400与slr0770/slr0771共表达,通过亲和捕捉技术共纯化重组蛋白,并以质谱分析鉴定重组蛋白,证明TA系统编码的毒素蛋白和抗毒素蛋白之间的相互作用。
2)通过选择性表达系统选择性表达集胞藻PCC6803依赖ATP的蛋白酶基因lons或clpP2s/Xs和sll2733/sll1400或slr0770/slr0771TA系统组分,分析选择性表达蛋白酶和TA系统组分对细胞生长的影响,确定蛋白酶对TA系统激活的作用;利用蛋白质免疫印记(Westernblot)技术证明蛋白酶对抗毒素具有降解作用。
3)通过基因敲除技术构建slr0770/slr0771缺失突变株DR947和sll2733/sll1400缺失突变株DR948,分析不同温度胁迫条件下缺失突变株DR947和DR948的生长表型;
4)以lazZ为报告基因,构建sll2733/sll1400或slr0770/slr0771系统与lacZ融合转录的调控突变株,分别分析TA系统编码产物对TA系统转录的调控作用,以及TA系统之间的相互调控作用。
通过上述研究得到以下结论:
1)在sll2733/sll1400和slr0770/slr0771TA系统中,抗毒素蛋白Sll2733与毒素蛋白Sll1400、抗毒素蛋白S1r0770与毒素蛋白Slr0771在体内相互作用形成复合体。抗毒素Sll2733或Slr0770通过与相应的毒素蛋白Sll1400或Slr0771形成复合体抑制毒素蛋白的细胞毒性作用。
2)集胞藻PCC6803中的蛋白酶Lons和ClpP2s/Xs都能降解sll2733/sll1400和slr0770/slr0771TA系统中的抗毒素蛋白Sll2733与Slr0770;Lons和ClpP2s/Xs的诱导表达可降解毒素-抗毒素复合体中的抗毒素蛋白、释放毒素蛋白,并能激活sll2733/sll1400和slr0770/slr0771TA系统,使细胞生长受到抑制。
3)sll2733/sll1400和slr0770/slr0771缺失突变对试验胁迫条件下的集胞藻细胞的细胞活性无显著的影响;提示sll2733/sll1400slr0770/slr0771系统可能介导尚待鉴定的特异胁迫因子诱导的细胞生长抑制,使蓝藻适应某种环境胁迫。
4)sll2733/dll1400和slr0770/slr0771TA系统的启动子均具有转录活性,但与已报道的TA系统转录调控模式不同:抗毒素Sll2733或Sll2733/sll1400复合体对sll2733/sll1400TA系统的转录不存在调控作用;单独抗毒素Slr0770对启动子Pslr0770的正调控作用比毒素-抗毒素Slr0770-Slr0771对启动子Pslr0770的正调控作用要显著。