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肺癌是最常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康，在全球范围内肺癌约占全部恶性肿瘤新发病例的17％，在肿瘤相关死亡患者中约占23％，其发病率和死亡率呈逐年升高趋势并高居恶性肿瘤之首。目前肺癌晚期患者5年生存率不足10％，因此如何提高肺癌患者远期生存率是肿瘤临床和机制研究的热点。 肿瘤细胞的发生发展，归根结底源于细胞基因表达的失调，尤其是与凋亡及增殖相关的基因表达失调有关。RNA剪接是在真核细胞中，遗传信息从DNA形成mRNA的过程中，除去内含子，连接外显子，形成具有连续编码功能的mRNA分子的过程，最终可以形成两种及以上的外显子组合亚型。RNA剪接是调控基因表达和形成蛋白质组多样性的重要机制，mRNA前体的剪接过程是大多数基因表达最为关键的一步。在剪接过程中由于各种原因导致剪接不能正常进行，而异常剪接通常与肿瘤的发生发展密切相关。SRSF1是剪接因子家族中的代表性成员之一，主要生理功能包括mRNA运输与加工，RNA前体剪接，细胞周期和凋亡调控等。但SRSF1在肺癌中的作用机制尚不明确。 前期的研究工作中，我们发现与细胞凋亡相关的蛋白Anxa5在肺癌中低表达。而高表达Anxa5后可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并可影响EMT过程中关键蛋白的表达。通过二甲基稳定同位素标记及质谱联用法对高表达Anxa5细胞株和空载细胞株的蛋白表达谱进行差异分析，发现SRSF1在两株细胞中表达有差异，并利用western blotting进行了验证。那么，SRSF1在肺癌中发挥什么作用呢？是否也和凋亡有关呢？在肺癌细胞迁移和侵袭中是否也发挥作用呢？其作用机制是什么呢？为此我们进行了相关研究。 目的: 1、检测SRSF1的表达水平对肺癌细胞放射损伤的影响，以明确SRSF1与肺癌细胞放射敏感性的关系。 2、利用RNA-seq技术分析放疗后肺癌细胞中与SRSF1基因相关的剪接事件的变化，为进一步研究奠定基础。 3、探讨SRSF1参与肺癌放疗后DNA损伤及修复的分子机制研究，以期为今后肺癌的治疗提供新的方向和新的靶点。 方法: 1、生物信息学分析: (1)在CNKI基因数据库中筛选出与放疗敏感性相关的基因，选取FPKM值＞3的基因;发现与Anxa5相关的SRSF1蛋白与放疗敏感性最为相关。 (2)利用Western blot在细胞中验证放疗后SRSF1蛋白的变化。 2、稳定沉默SRSF1肺癌细胞株的建立及相关表型研究: (1)质粒构建:选取pLKO.1、SRSF1-siRNA1、SRSF1-siRNA2三种种质粒用慢病毒包装后进行转染，筛选出稳定沉默目的基因的肺癌细胞株。 (2)细胞株验证:利用Western blot和q-PCR技术验证SRSF1基因的表达。 (3)表型检测:利用平板克隆实验、CCK-8细胞生长实验、细胞凋亡实验检测SRSF1低表达的肺癌细胞在放疗后的恶性生物学行为变化。 (4)放疗后DNA损伤验证:利用免疫荧光技术检测放疗后γ-H2AX、p-Chk2在细胞内定位及表达量的变化，利用彗星拖尾实验检测放疗后细胞内DNA损伤，利用Western blot技术检测细胞内γ-H2AX、p-Chk2在蛋白水平的变化。 3、全基因组RNA测序: (1)将放疗后SRSF1敲降的肺癌细胞提取RNA并行全基因组测序。 (2)验证生物信息学准确性:利用GO分析和STRING分析筛选出与SRSF1相关的基因，利用RT-PCR技术验证。 (3)验证剪接事件的准确性:利用GO分析和STRING分析筛选出与SRSF1相关的剪接基因，利用PT-PCR技术验证剪接事件。 结果: 1、SRSF1基因对肺癌细胞放射损伤的影响 (1)生物信息学分析结果表明:与放疗敏感性相关的基因（FPKM值＞3）共有30个，SRSF1基因的表达与放疗敏感性最为相关，Western blot结果表明，SRSF1基因在放疗后蛋白表达量明显增高。 (2)表型实验表明:沉默SRSF1基因组的肺癌细胞比对照组细胞形成克隆形成数目减少、细胞生长缓慢，放疗后沉默SRSF1发肺癌细胞的克隆形成数目、细胞生长速度比对照组细胞进一步减少。细胞凋亡实验表明:放疗后SRSF1敲降组细胞凋亡比例明显多于未放疗组细胞。 (3)DNA损伤实验检测结果:免疫荧光实验结果表明:放疗2h后γ-H2AX在SRSF1敲降组的表达量明显高于对照组。彗星拖尾实验显示放疗0.5h后，SRSF1敲降组细胞的拖尾长度明显长于对照组。Western Blot结果表明，放疗后γ-H2AX在SRSF1敲降组的表达量比对照组明显增加。 2、分析肺癌细胞中SRSF1基因引起放疗后剪接事件的变化 (1)放疗后生物信息学分析:敲降SRSF1的肺癌细胞放疗后提取RNA进行全RNA测序，利用GO分析筛选出与SRSF1相关的基因，发现这些基因分别参与了细胞周期调控、细胞粘附、代谢过程、磷酸化、转录、基因表达等功能，STRING分析表明这些参与剪接事件的基因主要参与细胞黏附及线粒体内ATP的合成，参与细胞黏附的剪接因子有PTPMT1、PPLP1、RPS3A、RPLP2、MYL6等，。 (2)剪接验证:根据GO分析及STRING分析分别随机选取6个基因，RT-PCR验证结果表明其表达量改变与生物信息学分析结果一致。 3、SRSF1参与肺癌放疗后DNA损伤及修复的分子机制研究 (1)SRSF1表达水平对PTPMT1剪接体变化的影响:SRSF1敲降后PTPMT1A的剪接体减少而PTPMT1B的剪接本增多，当SRSF1过表达后PTPMT1A的剪接体增多而PTPMT1B的剪接本减少。 (2)PTPMT1长短剪接体变化对细胞表型影响:过表达PTPMT1B，分别用0Gy、2Gy、4Gy、6Gy的射线照射，过表达PTPMT1B的肺癌细胞形成克隆数目减少、细胞生长减慢，放疗后过表达PTPMT1B的肺癌细胞生长最慢。 (3)PTPMT1短剪接体变化对细胞核内DNA影响:免疫荧光实验检表明过表达PTPMT1B的肺癌细胞在放疗后2h，细胞核内γ-H2AX表达比对照组增加。Western blot实验表明，在蛋白水平过表达PTPMT1B的肺癌细胞在放疗后γ-H2AX和p-Chk2表达增高。彗星拖尾实验进一步表明过表达PTPMT1B的肺癌细胞在放疗0.5h和4h时细胞拖尾现象明显长于对照组。 (4)PTPMT1长剪接体变化对细胞表型影响:在Ctl sh1+Ctl、SRSF1sh1+Ctl、SRSF1sh1+PTPMT1A三种细胞株中，平板克隆形成实验表明在不同剂量的射线(0Gy、2Gy、4Gy)照射后，SRSF1sh1+PTPMT1A组细胞形成克隆数目均比SRSF1sh1+Ctl及Ctl sh1+Ctl增多。免疫荧光实验表明，γ-H2AX在Ctl sh1+Ctl和SRSF1sh1+PTPMT1A组细胞内的表达量均比SRSF1sh1+Ctl减少，表明SRSF1敲降后再过表达PTPMT1A可以减少细胞核内DNA损伤。Western blot实验表明，γ-H2AX蛋白在Ctl sh1+Ctl和SRSF1sh1+PTPMT1A组细胞内的表达量均比SRSF1sh1+Ctl减少。 (5)SRSF1参与肺癌放疗后DNA损伤及修复的分子机制:Western blot实验表明，对照组Ctl sh1及SRSF1sh1肺癌细胞在放疗0h、1h、6h、12h、24h，p-MAPK蛋白在对照组Ctlsh1放疗后随着时间的延长，其蛋白表达量呈现减少趋势，在24h时含量明显少于SRSF1sh1组，SRSF1sh1组放疗后p-MAPK蛋白减少趋势明显延迟。同样Western blot结果表明，PTPMT1B过表达后p21和p27蛋白表达量增加，p-MAPK和mTOR蛋白无明显变化，而当PTPMT1B过表达的肺癌细胞放疗后p-MAPK蛋白表达含量明显增加，p21和p27蛋白表达量也相应增加，但mTOR蛋白减少。 结论: 1、SRSF1基因表达下调可以增加肺癌细胞的放射损伤，使DNA双链断裂增加。 2、SRSF1可以影响肺癌放疗敏感性，有望成为肺癌患者评价放疗疗效及预后的指标之一。 3、SRSF1基因很可能通过选择性剪接事件参与肺癌细胞的放疗抵抗。 4、SRSF1介导PTPMT1（PTPMT1A促癌剪接本和PTPMT1B抑癌剪接本）的选择性剪接来影响肺癌细胞的放疗抵抗是通过抑制AMPK/mTOR信号通路来实现的。 5、研究SRSF1抑制剂或者PTPMT1A抑制剂将有利于找到肺癌放射敏感性相关的药物作用靶点，有望为肺癌的治疗提供实验依据和理论基础。