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目的:以人乳腺癌MCF-7细胞及其耐阿霉素MCF-7/ADM细胞为模型,研究姜黄素介导的光动力疗法诱导肿瘤细胞凋亡及其凋亡机制,并探讨姜黄素酸敏感脂质体联合光动力疗法的体外抗肿瘤活性。为姜黄素介导的光动力疗法的临床应用提供基础研究,同时为克服肿瘤多药耐药提供一定的依据和思路。方法:1.采用高效液相色谱法对姜黄素进行分析方法学考察和验证,为后续实验提供分析基础。2.采用MTT法考察姜黄素介导的光动力疗法对MCF-7细胞和MCF-7/ADM细胞的细胞毒作用。采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测方法评价姜黄素介导的光动力疗法诱导细胞凋亡的能力。结合免疫荧光法观察凋亡细胞的细胞形态、细胞骨架蛋白及细胞核的变化程度。3.通过细胞活性氧水平、细胞线粒体膜电位以及凋亡相关蛋白的检测,探讨姜黄素介导的光动力疗法诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。4.采用薄膜超声法制备姜黄素酸敏感脂质体,以粒径、PDI、包封率、载药量和释放度为指标优化处方和工艺。通过细胞毒实验和细胞凋亡实验评价姜黄素酸敏感脂质体联合光动力疗法对MCF-7和MCF-7/ADM细胞的抗肿瘤活性。结果:1.建立了姜黄素的高效液相分析方法,且符合方法学要求,可用于姜黄素的定量分析。2.(1)MTT结果显示,光动力疗法能显著增强姜黄素对MCF-7和MCF-7/ADM细胞的细胞毒作用,呈浓度依赖性。且敏感株和耐药株的细胞毒作用无显著性差异。(2)采用流式细胞仪测定MCF-7和MCF-7/ADM细胞的凋亡率,光处理组的凋亡率分别为(56.80±7.64)%和(57.07±5.89)%,与对照组相比,具有显著性差异(P<0.001)。同时,经一定浓度的姜黄素光照射处理后,细胞变圆、皱缩明显,骨架蛋白呈疏松排列,细胞核变小、破碎不完整。实验结果表明,姜黄素介导的光动力疗法能显著诱导MCF-7和MCF-7/ADM细胞凋亡,并且在诱导凋亡的同时伴随着骨架蛋白和细胞核的形态一定程度上的破坏。3.(1)细胞活性氧实验表明,姜黄素光照处理后在给定的时间范围(2,4,6,8,10,12h)内对MCF-7和MCF-7/ADM细胞活性氧水平均呈现上升趋势,其中6h达到最大值。该结果提示姜黄素介导的光动力疗法通过升高细胞内活性氧诱导细胞凋亡。(2)采用JC-1染料检测MCF-7和MCF-7/ADM细胞线粒体膜电位情况。红色荧光代表线粒体膜电位较高,细胞处于正常状态;绿色荧光代表细胞处于凋亡状态,伴随着线粒体膜电位的降低,通常以红绿色荧光的相对比例来衡量线粒体去极化比例。MCF-7细胞和MCF-7/ADM细胞光处理组红绿荧光比值分别为(1.14±3.68)%和(1.27±2.94)%,与对照组相比,两组结果均具有显著性差异(P<0.001)。该结果表明姜黄素介导的光动力疗法能显著降低细胞线粒体膜电位,诱导细胞凋亡。(3)Western blot蛋白免疫印迹实验表明,MCF-7和MCF-7/ADM细胞的P-gp、细胞色素c、Caspase-3/7/9和PARP在姜黄素介导的光动力疗法作用24 h后,均发生了不同程度的剪切,与对照组相比,P-gp、剪切Caspase-3/7/9、细胞浆细胞色素c和剪切PARP的蛋白表达上调,线粒体细胞色素c的蛋白表达下调。表明MCF-7和MCF-7/ADM细胞主要是通过激活线粒体/细胞色素c而产生的内源性凋亡信号途径。同时,通过下调P-gp的表达克服肿瘤多药耐药。4.通过对处方组成和制备工艺的单因素考察,得到优化的处方与工艺如下:药脂比为1:40,胆固醇琥珀酸单酯用为8 mg,胆固醇用量为5 mg,吐温-80用量为0.1%,超声功率92W,超声/间隔20s/5s,总超声4min。该工艺参数制备得到的姜黄素酸敏感脂质体粒径及分散系数分别为(94.34±1.14)nm和(0.219±0.008);包封率和载药量分别为(100.89±5.19)%和(1.33±0.03)%;具有良好的酸敏感响应,在pH 5.5和6.5的酸性条件下姜黄素48h的累积释放度分别为(84.27±3.74)%和(90.41±1.87)%,而pH 7.4时药物基本不释放。MTT结果和细胞凋亡结果显示,姜黄素酸敏感脂质体联合光动力疗法对MCF-7和MCF-7/ADM细胞有显著的体外抗肿瘤活性。结论:本研究结果表明姜黄素介导的光动力疗法产生活性氧诱导肿瘤细胞凋亡。具体机制为:姜黄素在光照下产生活性氧增加细胞内总体活性氧水平,导致线粒体膜电位降低、外膜通透性增加,线粒体基质中的细胞色素c释放到细胞浆中,而后与Apaf-1和Caspase-9结合构成凋亡复合体。该凋亡复合体水解并活化下游Caspase-3/7,执行细胞凋亡,损伤DNA修复酶PARP,导致细胞出现染色质固缩、核碎裂,伴随着细胞骨架蛋白排列疏松,细胞变圆、皱缩等凋亡特征。另外,本研究制备的姜黄素酸敏感脂质体不仅改善了姜黄素的水溶性和稳定性差的特征,而且联合光动力疗法具有良好的体外抗肿瘤活性。