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前言
长期慢性高砷暴露可发展为机体多器官肿瘤。皮肤是砷中毒的主要靶器官之一,患者临床主要表现为掌跖皮肤过度角化、和皮肤色素异常沉着或脱失,病情严重者可见砷性Bowens病或皮肤癌。研究砷对皮肤的损害作用及其可能机制,并寻找针对慢性砷中毒皮肤损害的有效控制和治疗手段、降低砷所致皮肤癌的发病危险等具有重要的理论和现实意义。
大量研究已证实,无机砷暴露能够导致细胞损伤。亚砷酸钠(NaAsO2)可使人类角质细胞活力明显下降,高浓度的As2O3还可抑制正常人类角质细胞(NHK)和人类角质化细胞(HaCaT)的生长。砷还可使细胞周期异常改变,甚至发生细胞凋亡,以及一些周期相关蛋白的改变。大量研究还证实,氧化应激是砷致细胞毒性作用的重要机制之一。NaAsO2可引起细胞氧化损伤。同时人们也发现,细胞内ROS的水平对细胞周期调节具有重要影响。
另一方面,核转录因子Nrf2通路的活化是近年来发现的机体应对化学物和毒物毒性的一种主要的防御反应。Nrf2转位入核与抗氧化反应元件(ARE)结合,调控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的转录,可维持细胞氧化还原状态平衡和降低氧化损伤。研究还发现,叔丁基对苯二酚(tBHQ)是Nrf2转位入核的强烈诱导剂,具有极强的细胞保护作用。有关tBHQ拮抗砷毒性作用的研究发现,tBHQ能够阻断砷诱导的一些细胞毒性等损伤。但是目前,tBHQ对砷诱导的角质细胞损伤的可能影响尚未见报道。
据此,本研究拟选用人永生化表皮细胞HaCaT细胞系,观察tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞细胞毒性、细胞周期和相关调控蛋白改变的拮抗作用、tBHQ对无机砷致角质细胞氧化损伤的拮抗作用以及对细胞内Nrf2信号通路的诱导作用。为寻找针对慢性砷中毒皮肤损害的有效控制和治疗手段、减轻砷中毒患者的痛苦和提高生命质量、以及降低砷所致皮肤癌的发病危险性等提供理论依据和新的线索。
研究方法
1.AlamarBlue还原法测定HaCaT细胞增殖活力
2.倒置显微镜观察细胞形态改变
3.荧光探针2,7-二乙酰二氯荧光素检测细胞内ROS水平
4.流式细胞仪法测定细胞周期
5.硫代巴比妥酸检测法测定细胞内MDA含量
6.改进的黄嘌呤氧化酶检测法测定细胞内SOD活性
7.钼酸铵检测法测定细胞内CAT活性
8.Westernblot法分析细胞内Nrf2、NQO1、HO-1、CyclinD1和CDK4的蛋白表达水平
9.实时定量PCR法检测细胞内NQO1和HO-1的mRNA表达水平
结果
1.tBHQ对NaAsO2致HaCaT细胞增殖活力下降、细胞周期阻滞及其调控蛋白异常改变的拮抗作用
NaAsO2单独作用HaCaT细胞,AlarnarBlue还原率随染砷浓度的增加而明显下降,差异具有显著性(p＜0.01)。而tBHQ预处理后,细胞AlamarBlue还原率与相同浓度NaAsO2单独作用组相比明显恢复,且差异具有统计性(p＜0.01)。
NaAsO2单独作用HaCaT细胞,G0/G1期细胞比例明显下降(p＜0.01),S期和G2/M期细胞比例较对照组明显增加(p＜0.01)。tBHQ预处理后,tBHQ(50μmol/L)预处理的NaAsO2(25、50μmol/L)组细胞G0/G1期细胞比例有所上升(p＜0.01);tBHQ(50μmol/L)预处理的NaAsO2(50μmol/L)组S期细胞比例明显下降(p＜0.01);G2/M期细胞比例整体呈下降趋势。
NaAsO2单独作用于HaCaT细胞,细胞周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的蛋白表达随NaAsO2染毒浓度的增加而明显下降(p＜0.01)。tBHQ预处理后,CyclinD1和CDK4蛋白表达均明显高于相同浓度NaAsO2单独作用组(p＜0.01)。
2.tBHQ对NaAsO2致HaCaT细胞氧化损伤的拮抗作用
NaAsO2单独作用HaCaT细胞,细胞内ROS水平和MDA含量明显升高,同时SOD和CAT酶活性明显下降(p＜0.01)。tBHQ预处理后,细胞内ROS水平和MDA含量下降,而SOD和CAT酶活性明显恢复(p＜0.01)。
3.tBHQ对NaAsO2致HaCaT细胞内Nrf2蛋白、及Nrf2下游调控基因NQO1和HO-1蛋白和mRNA表达的影响
tBHQ单独作用可长时间持续诱导HaCaT细胞内Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达,且均明显高于对照组(p＜0.01)。
tBHQ预处理再与NaAsO2共同处理,Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达均明显高于相同浓度NaAsO2单独作用组(p＜0.01)。NQO1和HO-1的mRNA表达水平也明显高于相同浓度NaAsO2单独作用组(p＜0.01)。
结论
1.tBHQ对无机砷致人皮肤角质细胞的细胞毒性和细胞周期异常变化等具有一定的拮抗作用。
2.tBHQ能够减轻无机砷致人皮肤角质细胞的氧化损伤。
3.tBHQ能够活化人皮肤角质细胞的核转录因子Nrf2、以及Nrf2调控的下游靶基因NQO1和HO-1的基因转录和蛋白表达。