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课题一γ-分泌酶中Aph-1和Nicastrin蛋白降解途径的研究
第一部分：γ-分泌酶中Aph-1蛋白降解途径的研究
目的：研究细胞内Aph-1的蛋白降解是由泛素．蛋白酶体途径介导还是由溶酶体途径介导；Aph-1的蛋白表达水平与γ-分泌酶活性和Aβ产生的关系，研究结果将为揭示AD的发病机制及找到AD治疗的新途径提供依据。
方法：应用多种研究手段如细胞培养、Western blot、放射性同位素脉冲示踪技术、免疫沉淀、免疫荧光双标技术、ELISA等，并结合蛋白酶体和溶酶体酶抑制剂处理pz-Aphlmychis转染或未转染的神经细胞(N2a)和非神经细胞(HEK293)来检测细胞内Aph-1的蛋白表达水平。
结果：应用多种特异性蛋白酶体抑制剂处理N2a、HEK293细胞后，Western blot结果显示，神经细胞和非神经细胞的内源性和外源性Aph-1的蛋白表达水平显著提高(p<0.001)，且高度特异的蛋白酶体抑制剂对Aph-1表达的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性；而非蛋白酶体蛋白酶抑制剂ALLM和溶酶体酶抑制剂ChlQ对Aph-1的蛋白表达无影响(P>0.05)；放射性同位素脉冲示踪结果显示，蛋白酶体抑制剂可增强细胞内新合成的Aph-1蛋白的表达水平，其增强作用是通过阻止<35>S-Aph-1的蛋白降解来实现的；免疫沉淀及免疫荧光双标结果显示，Aph-1与泛素在细胞内共存并相互作用形成复合物；蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理Aph-1质粒转染的PS1/2双重基因敲除型或野生型细胞后发现，Aph-1的蛋白降解不受PS影响；ELISA结果显示，Aph-1质粒转染或Lactacystin所致的Aph-1过表达可引起细胞内Abeta40 andAbeta42的生成显著增多(p<0.001)。
结论：神经细胞和非神经细胞内Aph-1的蛋白降解由泛素-蛋白酶体途径介导，与溶酶体途径无关；Aph-1的泛素化降解不依赖于PS；Aph-1的过表达或其泛素化蛋白降解过程受阻均可促进APP的代谢及Abeta的生成。
第二部分：γ-分泌酶中Nicastrin蛋白降解途径的研究
目的：研究细胞内Nicastrin(NCT)的蛋白降解途径及相关机制；NCT在降解之前是否经泛素化修饰；NCT的蛋白表达水平与γ-分泌酶活性和Aβ产生的关系，以期为揭示AD的发病机制及找到AD治疗的新途径提供依据。
方法：在建立HEK293稳定表达NCT细胞株的基础上，应用多种研究手段如Western blot、放射性同位素脉冲示踪技术、亚细胞器分级分离技术、免疫沉淀、免疫荧光双标、ELISA等，并结合蛋白酶体和溶酶体酶抑制剂处理NCT稳定细胞株和未转染的神经细胞(SH-SY5Y、原代培养的神经元)和非神经细胞(HEK293)，以检测细胞内NCT的蛋白表达水平。
结果：应用蛋白酶体抑制剂和溶酶体酶抑制剂处理多种细胞株后发现，神经细胞和非神经细胞的内源性和外源性NCT的蛋白表达水平显著提高(p<0.001)，且各种特异性的抑制剂对NCT蛋白的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性；放射性同位素脉冲示踪结果显示，蛋白酶体和溶酶体酶抑制剂均可增强细胞内新合成的NCT蛋白的表达水平，其增强作用是通过阻止<35>S-NCT的蛋白降解来实现的；亚细胞器分级分离结果显示，正常情况下NCT主要分布于内质网和高尔基复合体，少量分布于溶酶体；免疫荧光双标结果提示，蛋白酶体抑制剂导致增多的NCT主要聚集在内质网和高尔基复合体；而溶酶体酶抑制剂导致增多的NCT主要聚集在溶酶体；免疫沉淀及免疫荧光双标结果提示，NCT与泛素在细胞内共存，且NCT在降解之前经泛素化修饰；蛋白酶体抑制剂Lactacystin处理NCT质粒转染的PS1/2双重基因敲除型或野生型细胞后发现，NCT的蛋白降解不受PS的影响；ELISA结果显示，NCT的过表达可引起细胞内Abeta40 and Abeta42的生成显著增多(p<0.001)。
结论：神经细胞和非神经细胞内NCT的降解由蛋白酶体途径和溶酶体途径介导；NCT在降解之前经泛素化修饰；NCT的泛素化降解不依赖于PS；NCT的过表达可促进APP的代谢及Abeta的生成。
课题二 丙戊酸钠对Alzheimers病的作用研究
目的：为检测GSK-3β的选择性抑制剂丙戊酸钠(VPA)对HEK293稳定表达瑞士突变型APP751细胞株(APP751swe)及APP23+/-转基因AD模型小鼠脑内APP代谢过程中Abeta产生的影响，并探讨VPA发挥作用的可能机制。本研究将为AD的有效治疗提供新途径。
方法：(1)离体实验：运用不同浓度的VPA处理APP751swe稳定细胞株48h，收集细胞培养液，通过ELISA定量测定Abeta水平；收集细胞，取细胞裂解液通过Western blot检测．APP代谢过程中相关蛋白的表达变化，以明确VPA对APP75 1swe细胞内APP代谢过程中γ-分泌酶活性及Abeta产生的影响；(2)在体实验：运用30mg/kg.d VPA和等量生理盐水腹腔注射APP23+/-转基因AD模型小鼠4周，通过Morris水迷宫和恐惧实验检测VPA对小鼠空间学习记忆力的影响；通过免疫组化、甲硫素S染色、免疫荧光化学、银染色等检测VPA对小鼠脑组织形态学改变的影响；通过Western blot、ELISA检测VPA对小鼠脑内APP代谢过程中γ-分泌酶活性及Abeta产生的影响。
结果：(1)离体实验：Western blot结果显示，不同浓度的VPA可引起APP751swe细胞内γ-分泌酶的底物C99、C83生成增多，对APP及PS全蛋白水平无影响；ELISA结果显示，不同浓度的VPA可引起APP751swe细胞内γ-分泌酶的产物Abeta40、Abeta42显著降低(P<0.01)；(2)在体实验：①行为学检测结果：在Morris水迷宫实验中，VPA注射组和生理盐水注射组小鼠在可视平台下找到平台的平均潜伏期及搜索的距离无显著差异(P>0.05)；VPA注射组小鼠在隐蔽平台下找到平台的平均潜伏期及搜索的距离显著低于对照组(P<0.01)；在空间探索实验中，VPA注射组小鼠跨越相应平台的次数明显多于对照组(P<0.01)；在恐惧实验中，VPA注射组小鼠在电击后瞬间或电击后24hFreeze的次数明显多于对照组(P<0.001)。②形态学观察结果：免疫组化和甲硫素S染色结果显示：与生理盐水注射组相比，VPA注射组小鼠大脑皮质及海马等区域的老年斑数量明显减少(P<0.001)；免疫荧光化学及银染结果显示，VPA注射组小鼠脑组织内神经元胞体和突起数量明显增加、纤维数量增多且排列有序。③蛋白水平测定结果：Westernblot结果显示，与对照组相比，VPA．注射组小鼠脑组织中γ-分泌酶的底物C99、C83蛋白表达显著增多，GSK-3β-pser9显著增多，但APP、PS及GSK-3β总蛋白水平无显著变化；ELISA结果显示，VPA注射组小鼠脑内γ-分泌酶的产物Abeta40、Abeta42显著降低(P<0.001)，与离体实验结果一致。
结论： VPA通过增强γ-分泌酶的活性显著减少APP751swe细胞及APP23+/-转基因AD模型小鼠脑内Abeta的生成；VPA可显著减少APP23+/-转基因小鼠脑内Abeta的沉积及SP的数量、同时可明显增加小鼠脑内神经元的数量；VPA可显著提高APP23+/-转基因小鼠的空间学习记忆能力。VPA是通过抑制GSK-3γ的活性来发挥其治疗作用。