二球悬铃木花发育相关基因功能的初步验证及遗传转化

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悬铃木冠大荫浓、生长迅速、适应能力强,耐修剪、抗逆性强,具有较强的空气净化能力和抗污能力等,被誉为“行道树之王”,是重要的园林绿化树种之一。但悬铃木的落果飞毛不仅污染环境,而且严重影响了人们的生活及身体健康。关于悬铃木果毛污染,目前在国外研究甚少,在国内虽然进行了多方面的研究,但未能从根本上解决问题。本课题针对这一情况,根据当前植物开花关键基因和MADS-box基因研究的最新进展,拟通过基因工程的方法抑制悬铃木内源花发育关键基因(如花分生组织决定基因、花器官形成决定基因等)的表达,以干扰悬铃木的开花及花器官发育,为培育少毛或无毛悬铃木奠定基础。同时,为初步验证悬铃木花发育相关基因的功能,将其正义、反义植物表达载体通过农杆菌介导转入模式植物烟草中,以观测转基因烟草在开花时间、植株形态、花器官发育和果实发育等方面的表型变化。另外,为提高悬铃木的遗传转化效率,优化了相关实验条件,并进行了悬铃木相关目的基因的转化。主要结果如下:1构建了悬铃木花发育相关基因的反义表达载体,包括PaLFY、PaFUL、PaAP3、PaSEP1、PaSEP3反义表达载体和PaLFY-FUL串联反义表达载体。2通过农杆菌介导将PaLFY、PaFUL、PaAP3、PaSEP1、PaSEP3正义、反义表达载体及PaLFY-FUL串联反义表达载体导入烟草。对抗性植株进行PCR检测,结果表明外源基因均成功导入到烟草中。对转基因烟草的T0代进行数据统计和表型观测,与对照相比:(1)PaLFY正义转基因烟草花期提前、叶片数减少、植株矮小,PaLFY反义转基因烟草表型不明显。(2)PaFUL正义转基因烟草花期提前、叶片数显著减少、植株矮化,强表型植株主茎上会形成多个侧生花枝,这些花枝会进一步形成二级花枝,大部分侧生花枝都高于主茎花序;PaFUL反义转基因烟草花期延迟,叶片数增加,但株高、节间距、叶长、叶宽与对照相比均没有显著差异。(3)PaAP3正义、反义转基因烟草的营养生长和花期均没有显著差异,但部分PaAP3正义转基因烟草花冠边缘褶皱,有的花冠筒缺裂,甚至出现较小的类似花瓣状的副瓣;部分PaAP3反义转基因烟草花冠筒变短,雄蕊和柱头外露,或花冠筒和雄蕊都变短而柱头外露。(4)PaSEP1、PaSEP3正义转基因烟草花期提前、植株矮化、节间距变短、叶片数显著减少、叶片变小。其中PaSEP3正义转基因烟草强表型植株主茎上会形成多个侧生花枝,这些花枝会进一步形成二级花枝,大部分侧生花枝都高于主茎花枝,且部分植株会产生单朵顶生花;而PaSEP1、PaSEP3反义转基因烟草的株高、节间距、叶片数、叶长、叶宽、始花期与对照相比均没有显著差异。(5)PaLFY-FUL转基因烟草的株高、节间距、叶片数、叶长、叶宽、始花期与对照相比均没有显著差异。为了获得纯合转基因烟草植株,进一步验证转基因的遗传稳定性,分别收获T0代转基因烟草种子,进行T1代种植以进一步分析这些基因的功能。3为提高悬铃木的遗传转化率,首先从236个株系中筛选了部分可再生分化的株系,初步确定了两个优良株系C19、Q55作为后续实验材料,其再生率分别可达70%以上;同时对悬铃木试管苗增殖和抗性芽分化的培养基进行了调整,分别选用MS+BA0.4 mg/L+NAA0.05 mg/L和MS+BA5.0 mg/L+IBA0.5 mg/L作为其增殖和分化培养基。4通过农杆菌介导的悬铃木的遗传转化,分别得到正义PaFT、正义PaSEP3、反义PaLFY、反义PaFUL、串联反义PaFUL-LFY若干抗性株系,但PCR检测结果为假阳性。其原因有可能是共培养时间减少,延迟培养时间过长等。BpFUL-Barnase抗性植株目前还处于壮苗阶段,尚未检测。
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