乙醛脱氢酶2的表达、纯化和活力研究

• 作 者: 刘康佳
• 出 处: 暨南大学
• 发表日期: 2021年03期
• 关键词: 乙醛脱氢酶2 大肠杆菌 TrxA融合蛋白标签 酿酒酵母 酶活力

人体摄入酒精后,在代谢过程中会产生乙醛和乙酸。其中乙醛是一种对人体有害的物质,被列为二类致癌物,在人体内蓄积过多会导致恶心、呕吐等不适反应,甚至引发休克。研究表明,乙醛脱氢酶2(ALDH2)是人体内参与乙醛氧化的关键酶,可以将乙醛氧化为乙酸。但是,ALDH2突变体会使其活力明显下降,而无法顺利清除的乙醛可能会造成DNA损伤,从而导致血液疾病,甚至是癌症。高活力ALDH2的补充可以缓解乙醛对人体的损害。因此,寻找一种更优化的方法获得大量高活力的ALDH2蛋白,可以为后续应用研究提供科学依据。因此,本论文围绕ALDH2开展了以下三个方面的研究工作。一、健康人群的酒精代谢能力筛查收集健康人员的漱口水样品,采用Easy Pure?Micro Genomic DNA Kit试剂盒从样品中获取人全基因组,并使用SNP分析法分析GABRA2、ADH1B、ALDH2三种基因的基因型,从而推知该受检者的酒精代谢能力。结果显示,在测试人群中,约有20%的人因为ALDH2突变体导致乙醛代谢能力下降。二、乙醛脱氢酶2的原核表达与纯化许多人因为ALDH2突变体导致乙醛代谢能力下降,需要补充外源性ALDH2。为了获得大量的人源ALDH2蛋白,将人源ALDH2基因构建到含有TrxA融合蛋白标签的p ET32a载体上,再将该质粒转入大肠杆菌中,并对其进行表达条件优化,使TrxA-ALDH2的可溶性表达量达到最高。使用TrxA融合蛋白标签后,TrxA-ALDH2的可溶性表达比ALDH2提高了97.5%。对TrxA-ALDH2包涵体蛋白进行了复性条件研究,在最优的复性条件下,复性后的TrxA-ALDH2比活力为0.510 IU/mg,可以达到可溶性表达蛋白的58.32%。三、乙醛脱氢酶2的真核表达与纯化由于大肠杆菌表达体系的限制性,导致较多包涵体蛋白的产生,因此我们进一步探究了人源ALDH2在酿酒酵母中的表达情况。成功构建了ALDH2-p YX212和ALDH2-p YES2表达载体,并在酿酒酵母中进行游离表达(ALDH2-YX和ALDH2-YS菌株),结果显示,通过该真核表达系统,也得到了具有一定酶活的ALDH2蛋白。小结:本论文筛查了部分健康人群体内的饮酒相关基因的突变情况,发现在测试人群中,约有20%的人因为ALDH2突变体导致乙醛代谢能力下降,需要补充外源性ALDH2。我们将人源ALDH2基因分别在大肠杆菌和酿酒酵母中进行诱导表达;并且对两种表达方式的目标蛋白进行了分离、纯化和活力研究。目前,市场上尚无解酒功效的ALDH2产品,本论文为人源ALDH2蛋白的规模化制备和应用研究提供科学依据。