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细胞凋亡是人体内重要的生命现象之一，细胞的凋亡不足或凋亡过度关系着一系列重大的急待解决的疾病，如肿瘤和神经退行性疾病等。有关凋亡与肿瘤发生发展关系的研究，以往多集中于凋亡细胞的形态学、生化指标的改变以及基因调控凋亡等方面。近年来的研究发现，线粒体不仅是动物细胞内的主要产能中心，也是在细胞凋亡中起关键作用的调控核心。有关线粒体在食管癌细胞凋亡中所起核心作用的系统研究，国内外尚未见报道。为探讨食管癌细胞凋亡过程中线粒体所起的具体作用，本课题采用流式细胞检测、分子生物学和激光共聚焦扫描技术等手段，研究了食管癌细胞凋亡中，线粒体所起关键作用的环节—线粒体通透性转变孔(Mitochondrion Permeability Transition Pore，MPTP)、线粒体跨膜电位ΔΨm和线粒体释放反应中的Caspase-3(Cysteine protease-3)；同时研究了食管癌手术切除标本中癌灶、癌旁和切端三处组织的细胞线粒体跨膜电位的特性。以期阐明线粒体在食管癌细胞凋亡过程中发挥的核心作用，并为以线粒体为靶向抗肿瘤药物的设计及在肿瘤治疗中的应用提供理论依据。全文共分三部分。 第一部分食管癌细胞凋亡发生中线粒体跨膜电位变化特征的研究 线粒体跨膜电位下降甚至崩溃是细胞凋亡发生的早期分子事件，为了阐明这一早期分子事件在细胞凋亡发生中的调节作用，本部分实验首次采用线粒体膜电位特异荧光探针JC-1 (5，5’，6，6’-tetrachloro-1，1’，3，3’-tetraethylbenzimidazol郑州大学2002年博士研究生论文 食管癌细胞凋亡中线粒体跨膜电位和Caspase－3的作用及食管癌组织中线粒体跨膜电位特性的研究m切叩m呐，JC－l）己食管癌细胞株 EC9706细胞，结合流式细胞检测技术，在放、化疗诱导细胞凋亡的过程中，观察线粒体跨膜电位变化的情况，并用 一环泡菌素 A作为 MPTP的阻滞剂，观察 MPTP阻滞后，细胞凸 W m的变化走势，同时，利用流式细胞仪检测细胞膜磷脂酚丝氨酸呼hosPhatid叫serine，PS）外翻的技术来检测细胞的早期凋亡。一 实验数据采用SPSS统计软件通过X’检验、方差分析进行统计学处理。 结果： l 以 15 11 g／nil、30 11 g＊、60 11 g／ml不不同剂量的顺 宅（CISplatin，伎CP）诱导食管癌细胞凋亡时，其中 CP30 p g／ml作用细胞 24h的时间段上，可见早期凋亡细胞数量明显增加，与未用药对照组相比，统计学分析结果显示具有高度显著性差异o1．00人 CP60 11 g恤作用细胞 16h时，可见 一通过凋亡而死亡的细胞比例明显增高。与未用药对照组相比，统计学分析结果显示具有高度显著性差异o＜0刀01人表明化疗药物顺铂在这两种剂量下，能诱导细胞发生凋亡。＿ 2 H不照射剂量以15GY、20GY、30GY照射EC9706细胞，在照射后培养 12h的时间段上，虽未发现明显早期凋亡细胞数量的增加，但通过 一凋亡而死亡的细胞数量有较明显的增加。其中，30GY照射过的细胞与未照射对照组相比，统计学分析结果显示具有高度显著性差异0叩刀01人 3 JCl标记线粒体发出红色荧光代表高电位，绿色荧光代表低电位，山其中CP30 v g／Inl作用细胞20h时，JC刁标记线粒体的红色荧光强度值有较大幅度的下降，绿色荧光强度值改变不如红色荧光明显。与未用药对照组相比，统计学分析结果显示红色荧光强度值差异具有高度显著性 一0功刀of人绿色荧光强度值具有显著性差异o叼刀5）；CP60ll归作用细胞 10h时，即有红色荧光强度的明显下降，作用到 24h时，不仅红色荧光强度下降，绿色荧光也有明显下降。与未用药对照组相比，统计学分析 问结果显示红、绿荧光强度均具有高度显著性差异0功刀01人 4在三种剂量照射后培养 10h的时间段上，随照射剂量的增加，细胞－ 二郑州大学2002年博士研究生论文 食管癌细胞凋亡中线粒体跨膜电位和＊一ps＊刁的作用及食管癌组织中线粒体跨膜电位特性的研究线粒体的红色荧光强度值逐渐下降，绿色荧光强度变化不如红色荧光强度大。其中，30GY照射后培养10h的细胞与未照射对照组相比，统计学分析结果显示红、绿荧光强度差异均具有显著性0功刀01人 5 MPTP阻滞后，3 0 p g／ml作用细胞 24h时，未见有明显早期凋亡细胞比例的改变。与阻滞前相比，统计学分析结果显示早期凋亡细胞比例差异具有高度显著性0＜0刀01人 另外，J乙1标记线粒体跨膜电位中，红色荧光强度值下降的趋势弱于MPTP未经阻滞时的下降趋势。在20h和 24h这两个跨膜电位曾明显下降的时间段上，MPTP阻滞后的八 W m则处于中等强度上。其中 30V g／Inl作用 20h时的细胞与末阻滞时相比，统计学分析结果显示红色荧光强度差异具有高度显著性0功刀01人 绿色荧光强度差异不具有显著性0叩刀5人第二部分 食管癌细胞凋亡过程中Caspase＊ nltvA和蛋白水平的表 达及相关指标的研究 由于Caspase家族通过一连串瀑布式酶级联反应，最后通过激活Ca