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灵长类特异的KRAB锌指基因约占人类基因组KRAB锌指基因的30％。目前国际上有关灵长类特异锌指基因的功能知之甚少。我们选择锌指基因ZNF480为模型研究灵长类特异锌指蛋白的功能。
ZNF480基因在肌肉和心脏组织中高表达,提示该基因可能与肌肉和心脏组织的发育有关。半定量RT-PCR和western blot实验证明,在诱导的C2C12稳定转染细胞的肌分化过程中,ZNF480的mRNA和蛋白质水平持续上调,说明ZNF480与肌分化过程密切相关。
为了从形态上检测ZNF480是否调控肌生成的过程,我们通过形态学和肌肉分化特异性抗体MHC对诱导分化的稳定系细胞进行免疫荧光检测。与载体过表达对照组比较,过表达ZNF480促进C2C12细胞形成更多的肌管和多核细胞,并且ZNF480稳转细胞的肌管和多核细胞随着分化过程的进行而逐步增多。
Myf-5,myogenin,MyoD是bHLH生肌调节因子,而E47,E12则是普遍表达的bHLH蛋白。在肌分化过程中,MyoD和Myf5表达是决定多能性体节细胞定型为成肌细胞的关键步骤,myogenin在成肌细胞的终极分化中有重要作用。我们检测了ZNF480是否对这些基因进行调控。半定量RT-PCR和western blot实验证明,ZNF480能上调肌肉特异性bHLH转录因子和肌肉特异性基因MCK(肌肉激酶)的mRNA水平,以及MHC和myogenin的蛋白水平,说明ZNF480是通过调控bHZH和MCK促进肌分化。同时,ZNF480过表达的C2C12稳定系分化过程中,p21的蛋白水平明显上调,说明ZNF480通过激活p21使细胞退出细胞周期而进入细胞分化。
利用荧光素酶活性实验,我们检测到ZNF480在NIH3T3细胞中并不能促进E12或MyoD对MCK启动子(MCK4800和4RTK)活性的调节,但ZNF480能与E12/MyoD共转时增强MCK启动子的活性,说明ZNF480是通过与E12/MyoD协同调节MCK启动子的活性。
为了进一步检测ZNF480是否结合到MCK和myogenin的启动子上对其进行转录调控,我们利用EMSA实验,证明了ZNF480不能直接结合到MCK启动子上,但是能够与E12/MyoD形成蛋白复合体结合到MCK的启动子区域。同时,EMSA实验证明ZNF480能够直接结合到myogenin的启动子区域。这些结果表明ZNF480通过形成蛋白复合体或直接结合的方式来调节MCK和myogenin的启动子活性,从而参与肌肉分化的调控过程。
综上所述,灵长类特异人类锌指蛋白ZNF480能够促进肌管发生过程,通过调节肌生成调节因子Myf-5,MyoD和myogenin以及肌肉特异性基因MCK来调控肌生成。