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原发性肝癌(primary hepatic carcinoma)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,死亡率高,仅次于胃、食道癌。而在我国原发性肝癌已成为恶性肿瘤第2位的杀手,每年死于肝癌的患者约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45％。原发性肝癌发病率因地区而异,以非洲和东南亚较高,其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌的90％。虽经多年不懈努力,肝癌的临床研究已经取得了很多重大进展；但大部分病人确诊时已是晚期且预后很差,肝癌的总5年生存率仍低于5％。所以,从基础水平上对肝癌进行了解显得尤为重要。近些年来,随着生命科学的不断发展,我们对癌症的发生发展机制有了新的认识和了解,这有助于癌症的早期发现和治疗。
目前肿瘤干细胞学说从新的角度对肿瘤的发生给于阐明：即在肿瘤组织中,有很少的一部分肿瘤细胞具有自我更新能力,并且数量很少就可以形成肿瘤组织中表型各异的肿瘤细胞,这种细胞在临床放、化疗过程中不会被杀灭而保留下来。这也是肿瘤复发的一个重要原因。肿瘤干细胞学说已为众多学者认同。近年来的研究证明,在某些肿瘤组织中确实存在这样的一些细胞。
SP表型指细胞可以将荧光染料Hoechst33342排出,表现为细胞核不着色或者很低程度的着色的现象,人们将这种可以排出Hoechest33342的特性称为SP表型。利用流式细胞仪可以将这些不着色或者低着色的细胞加以分离,因分离得到的细胞具有SP表型,所以称之为SP细胞。SP细胞具有外排功能,具有排出荧光染料Hoechst33342、Rhodamine 123和叶酸等物质的作用,同时也发现具有排出米托葸醌等抗癌药物的作用；而赋予SP细胞具有这种表型和功能的主要是一种跨膜ATP结合转运蛋白ABCG2。
SP表型是干细胞的特征之一,目前,已经在多种生物的造血系统以及非造血组织的组织干细胞和胚胎干细胞中发现SP细胞的存在,推测它很可能是一种潜在的新的干细胞标志。也有大量实验证明很多来源于肿瘤组织的SP细胞具有肿瘤干细胞的某些特性,甚至对成瘤能力具有决定作用,所以推测SP表型是筛选肿瘤干细胞的标志。在当前缺乏有效的肿瘤干细胞筛选标志的情况下,确定SP表型与肿瘤干细胞之间的关系对肿瘤干细胞的深入研究就显得尤为重要。
目前,关于SP细胞与肿瘤干细胞的相互关系的研究尚不深入,并且在进行SP细胞比例分析时多采用的是体外建系并长期培养的肿瘤细胞系,长期的体外培养会严重影响细胞群体的生物学特性,所以实验结果不能充分说明SP细胞在肿瘤组织中的真实存在情况,而且也并不能完全确定SP细胞在肿瘤发生过程中所起的作用。为了明确SP细胞在人原发性肝癌组织中是否存在,并进一步探讨人源性肝癌SP细胞在肝癌发生中的作用,我们进行了以下实验研究。
本实验研究主要包括三部分。第一部分,通过FACS分析,研究了本实验室建立的人源性肝癌细胞系P2-HCC的SP表型,经过多次实验最终确定在P2-HCC细胞系中含有SP细胞,其含量为2.4％左右,并且该比例在细胞传代过程中不会发生显著变化,-定程度上证明所使用的培养条件不会引起该细胞系中SP表型的显著变化。第二部分我们采用有限稀释法克隆化培养从肝癌细胞系P2-HCC中分离建立了一系列细胞亚系,荧光染料Hoechst33342染色后选择出一株细胞核呈浅染的SP细胞亚系和一株细胞核呈深染的NSP细胞亚系,并通过RT-PCR和基因芯片技术对其干细胞标志基因、耐药基因、肝组织标志和Wnt信号通路分子基因表达差异进行了分析。结果显示在SP细胞中ABCG2基因较NSP细胞高表达,在SP细胞亚系中高表达胆系标志CK19,而在NSP细胞亚系中甲胎蛋白、白蛋白和葡萄糖-6-磷酸酶都相对高表达；而干细胞相关标志的检测结果显示,卵圆细胞标志CK14、造血干细胞标志Thy-1(CD90)在SP细胞亚系中相对高表达,造血及神经干细胞标志CD133则表达相对较低,Wnt信号通路中分子检测,beta-catenin、FAD5在NSP细胞亚系中含量高。利用上海生物芯片工程研究中心“肿瘤药物耐受和代谢基因相关芯片”高通量分析基因表达差异。基因芯片中共对比分析基因504个,其中上调基因44个,下调基因23个。差异表达基因中包括原癌基因、转录因子、细胞因子、信号通路相关分子,粘附分子及细胞外基质等。采用real-timePCR的方法对芯片结果进行了验证。随后将两种细胞以单独和混合的方式分别移植于NOD/SCID小鼠皮下,结果表明SP和NSP在高接种细胞数时都具有致瘤能力,而SP和NSP同时存在的条件下,低接种数量即可致瘤,表明肿瘤的形成可能需要两种细胞的相互作用。第三部分主要研究SP表型相关蛋白ABCG2与肿瘤发生之间的关系。首先对原发性肝癌的组织切片进行ABCG2蛋白的免疫组织化学分析,结果发现在肝组织中存在有ABCG2+的组织细胞,而在癌旁组织中缺少表达,提示ABCG2的表达与肿瘤的发生有着一定的相关性,并且ABCG2+细胞比例较低,这与FACS分析的结果一致。IHC结果显示在肝癌组织内部ABCG2+和ABCG2-细胞的确存在,提示SP细胞和NSP细胞可能存在于肿瘤组织内部,而不是由于体外培养条件造成的一种表型。另一方面,实验构建逆转录病毒载体pMSCVpuro-ABCG2,转染包装细胞phoenix。以phoenix包装细胞的产毒上清感染NSP细胞亚系,通过puromycin筛选获得高水平表达ABCG2基因的细胞系NSP-ABCG2。用RT-PCR及Western Blot的方法分别在转录和翻译水平进行鉴定,并通过real-time PCR的方法对细胞中的各种基因的改变做定量的比较。实验证明ABCG2基因的上调导致神经及造血干细胞标志CD133和白蛋白下调,CEACAM6、CK14、C-met、GST、THBS1则有不同倍数的上调。对转染前后的细胞进行比较发现,转染后细胞贴壁后,形态由原来的上皮样细胞转变成梭形,细胞增殖能力和体外克隆形成能力明显降低,而且NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力降低乃至消失。
本文通过对人原发性肝细胞癌细胞系P2-HCC的SP表型及相关蛋白ABCG2与肿瘤的发生相关性作了系统性研究,发现(1)P2-HCC细胞系的确存在一定比例的SP细胞；(2)癌干细胞相关特性比较研究发现,SP虽然高表达某些干细胞相关基因,但并不决定细胞的成瘤能力；(3)ABCG2蛋白的表达不但参与了SP表型的形成,而且会造成细胞多种生物学特性的变化,提示该蛋白与其它干细胞和癌症发生相关基因的表达有着密切的联系,揭示这种相关性对我们深入理解肿瘤的发生机理有着重要意义。