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急性心肌梗死是严重危害中老年人身体健康的常见病、多发病。目前临床缺乏针对患者梗死心肌的再造和再生的根本性治疗方法,虽然发病4-6小时内及时溶栓、介入治疗使梗死相关血管早期持续开通可挽救濒临死亡的心肌细胞,但绝大多数患者就诊时缺血心肌已有坏死,此时再灌注治疗只能防止梗死范围的扩大,而对于已坏死的心肌无效。由于成人心肌组织无分化再生能力,其坏死心肌细胞只能由成纤维细胞取代而形成无收缩功能的瘢痕组织,终致心衰,甚至猝死,严重影响患者生活质量和寿命。在这种情况下,有人提出可以通过再生心肌细胞,即心肌细胞成形术,来治疗缺血性心肌病导致的心肌梗死甚至心力衰竭,也就是通过移植外源性细胞到损伤的心肌中,用足量的具有收缩功能的细胞恢复和改善病变区域心肌的功能。目前在动物实验中有多种细胞被用来进行心肌细胞成形术,如胚胎心肌细胞、胚胎干细胞、成肌细胞(即骨骼肌卫星细胞)及骨髓间充质干细胞等被陆续用来做细胞移植治疗研究。来源于自身的骨髓间充质干细胞( marrow mesenchymal stem cells, MSCs)可在体外大量扩增,且具有多向分化潜能,能在适当的微环境中,分化为骨、软骨、脂肪、肝、神经、内皮、平滑肌、骨骼肌细胞和心肌样细胞。MSCs的应用由于没有医学伦理和免疫排斥等问题,目前是研究得较多的进行细胞移植以治疗缺血性心肌病的供体细胞。胚胎畸瘤细胞(embryonal carcinoma cells, EC)细胞与胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)在分化潜能、超微结构、细胞表面抗原和生化特性等方面具有相似性,同时与ES细胞相比, EC细胞在无需饲养层和白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factory, LIF)条件下培养即可保持未分化状态,更易于培养,且易于进行基因操作,而且通过分化培养过程EC细胞可从恶性表型转化为非恶性表型,因此EC细胞的研究应用日益受到广大研究者的青睐。P19EC细胞系是McBurney等从C3H/He小鼠畸胎瘤中分离得到的具有多向分化潜能的胚胎性干细胞,其在体外培养中单层生长无需饲养层即可迅速大量扩增,经多次传代仍保持胚胎干细胞特有标记,如表面糖蛋白SSEA-l及转录因子Oct-3等。在体外,通过条件培养P19细胞被诱导为包括心肌细胞、骨骼肌细胞、神经元等多种类型的细胞,且分化过程类似于胚胎细胞的早期分化。因此P19细胞常被作为研究细胞早期发育的体外模型系统。P19细胞向心肌细胞分化过程中,其发育相关基因的表达及电生理学特征基本模拟了正常小鼠心肌发育过程,被认为是研究心肌细胞发育的良好体外模型系统,其向心肌细胞的分化过程日益引起人们的关注。本课题拟通过应用不同方法、不同化学试剂体外诱导MSCs和P19细胞向心肌细胞分化,观察其分化过程中的形态学变化、心肌细胞早期转录因子及特异基因的表达,研究其生物学特性,摸索适宜骨髓间充质干细胞和P19细胞向心肌细胞分化的诱导方法,提高心肌细胞分化率,为建立高度标准化和最适宜的培养条件奠定基础;为大规模筛选心肌化干细胞的研究奠定基础;将胶体金标记的MSCs移植到SD大鼠冠脉结扎心梗模型的心肌组织中,观察移植细胞的生长分化情况和其在治疗心梗中的作用,探讨其作为进行细胞移植的供体细胞来治疗缺血性心肌病的可行性。本实验共分三部分。1探讨了大鼠MSCs的体外分离、纯化、扩增和向心肌细胞的定向诱导分化条件利用贴壁培养的方法从成年SD大鼠股骨和胫骨骨髓中分离纯化MSCs。MSCs培养于由IMDM培养液,10%特等优质胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和青霉素100 ug/ml、链霉素100μg/ml组成的完全培养基,首次于接种后24h换液,以后每3d换一次液。在相差显微镜下观察到:接种到培养瓶的原代细胞于接种后4小时开始贴壁,24小时后明显贴壁,3-5天后逐渐融合成片,细胞融合达80%-90%;原代培养的细胞较混杂,MSCs的形态大部分为梭形的成纤维细胞状,扁平状的细胞为其他基质细胞;随着换液次数的增加,悬浮的造血细胞逐渐减少,梭形的成纤维细胞状细胞逐渐增多。为了诱导MSCs向心肌分化,取材48小时后,将融合至70-80%的MSCs置入诱导培养基:10%优质胎牛血清、100 ug/ml青霉素、100μg/ml链霉素的IMDM中分别添加不同实验浓度的5-氮胞苷(5、10、15、μmol/L5aza)、二甲基亚砜(0.6%、0.8%、1.0% DMSO)、催产素(1×10-7、3×10-7、5×10-7μmol/L OT)、骨形态蛋白2(0.1、0.2、0.4ng/mL BMP-2)和碱性成纤维细胞生长因子(0.8、1.0、1.2ng/mL FGF-2)诱导剂。依次于24h、24 h、96 h、72 h、72 h后更换为完全培养基,阴性对照组采用完全培养基培养,每3天换一次液。为了鉴定各种诱导剂诱导分化的大鼠MSCs中是否含有心肌样细胞,进行了形态学观察和分子标志的检测。相差显微镜下观察到:在诱导后1-2w,少量成纤维细胞样的MSCs逐渐变长和变宽大,转变为具有肌管形成细胞形态特点的杆状或球状,椭圆形单核或多核细胞,到第3-4w部分细胞与周围细胞聚在一起。免疫细胞化学检测:诱导后的MSCs中均可见结蛋白(desmin),α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)、心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)阳性细胞,5μmol/L 5aza、1.0% DMSO、1×10-7μmol/L OT、0.2 ng/mL BMP-2、1.0 ng/mL FGF-2组阳性细胞明显较其他组多,细胞分化率最高(P<0.01),desmin、α-sarcomeric actin阳性率较高,而c-TnT阳性率较低。激光共聚焦扫描显微镜观察:可见细胞质内desmin的表达呈红色,cTnT的表达呈绿色,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。同样细胞质内有α-sarcomeric actin表达的呈红色,有C-TnT表达的呈绿色,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。透射电镜观察:分化细胞的细胞核位于细胞中央,细胞质内可见到平行排列的肌丝,大量的粗面内质网和线粒体,富含糖原和核糖体。半定量RT-PCR结果显示:诱导7d后,MSCs弱表达GATA4,21d时表达增强,28d时表达减弱。诱导7d后,MSCs不表达α-MHC,21d弱表达,28d表达明显。各时间点BMP-2诱导组基因表达均明显强于其它各组(P<0.01)。2骨形态蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子对P19细胞向心肌细胞分化的影响将P19细胞接种于铺有0.5%软琼脂的培养皿中,分别用含0.2 ng/mL BMP-2和1.0 ng/mL FGF-2的分化培养基培养P19细胞, 24h后即可见多个悬浮的细胞团形成。细胞团呈球形,形状较规则,直径随时间延长不断增大,至第4天形成细胞聚集体/EBs。将细胞聚集体/EBs接种于预置有盖玻片的24孔培养板中,用不含BMP-2和FGF-2的培养基继续培养。倒置显微镜下观察可见EB样结构形状规则,位于EB中央的细胞密集、颜色较深,为EB的内核。EB开始贴壁生长后,中央细胞多层排列,增殖速度较快,细胞体积较小,具有高核质比,为未分化细胞;由EB边缘逐渐爬出细胞,在周边形成单层的生长晕。细胞生长晕中一些细胞变形,胞体伸长,体积增大,细胞呈放射状排列。免疫细胞化学鉴定:EB边缘生长晕中变形的细胞表达α-sarcomeric actin和cTnT。α-sarcomeric actin阳性率较高,而c-TnT阳性率较低。激光扫描共聚焦显微镜观察:在激光的激发下,各实验组EB边缘生长晕的部分细胞胞质中有α- sarcomeric actin表达的连接通道呈红色丝状免疫荧光标记,有cTnT表达的连接通道呈绿色丝状免疫荧光标记,当两者同时被观察时可见其重叠的部位变成黄色。透射电镜观察未经诱导的P19细胞胞核较大,细胞器丰富分布于细胞核周围,胞质中可见大量糖原颗粒。诱导后的细胞接近心肌细胞,具有心肌细胞发育早期的特征:单一卵圆细胞核;细胞器丰富,有较多的线粒体、内质网和高尔基体;胞浆中有较成熟的平行排列的成束肌丝,尚未形成肌节样结构。3观察大鼠MSCs同种异体移植后在梗死心肌中的存活、分化及对左室功能的影响采用结扎左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。按照对MSCs的处理方式和心肌内注射的成分不同随机分为3组:A组12只,大鼠心肌梗死后接受MSCs移植治疗;B组12只,大鼠心肌梗死后移植经5-aza体外诱导的MSCs;C组12只,列为对照组,大鼠心肌梗死后注射等量培养基。纳入分组的对象排除了建模和心肌内注射等任一环节失败的实验动物。分别于干细胞移植后2周、4周,常规取材,通过HE染色观察移植细胞的存活和分布,通过心肌特异性肌钙蛋白(cTnT)和α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)的免疫细胞化学染色观察细胞形态学变化。HE染色观察到移植细胞分布于心外膜下、梗死区及与正常心肌的交界处。免疫细胞化学染色结果显示:(1)在移植2周,移植部位有较少的α-sarcomeric actin阳性细胞,在移植后4周,阳性细胞数量较多。(2)移植后2周,仅见个别移植细胞cTnT阳性表达。移植后4周,在位于移植区与正常心肌交界处的部分移植细胞胞质中cTnT表达阳性。免疫细胞化学鉴定结果证明在移植2周,MSCs开始向成肌细胞方向分化,4周后MSCs向心肌细胞分化。4周后通过血流动力学各项指标评价MSCs移植对大鼠心功能的改善情况。结果:与对照组C组相比,移植组A, B两组LV功能显著改善(P<0.01)。A, B两组之间无显著性差异。移植组左心室收缩压(LVSP)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp/dtmax)明显高于对照组(P<0.01),左心室舒张末期压(LVEDP)明显低于对照组(P<0.01)。结果提示:同种异体MSCs移植入大鼠心肌梗死区后能明显改善心肌梗死后大鼠的心功能。小结1大鼠MSCs在体外经5-aza、DMSO、OT、BMP-2、FGF-2诱导可定向分化为心肌样细胞。电镜及免疫细胞化学研究显示分化的心肌细胞具有早期心肌细胞的结构特征。2 5-aza、DMSO、OT、BMP-2、FGF-2诱导分化过程中MSCs内心肌细胞分化相关转录因子GATA4的表达随诱导时间变化提示它可能参与MSCs向心肌样细胞分化的转录调控。3 BMP-2、FGF-2暴露结合悬浮培养可有效的促使P19细胞聚集形成囊性EBs,并诱导P19细胞向心肌细胞分化。4同种异体MSCs可在梗死大鼠心脏存活、迁移分布,并能分化为心肌样细胞。5 MSCs在被移植到缺血心肌组织中后,周围的微环境可以诱导MSCs向功能肌细胞分化,导致移植后动物心功能明显增加。与未诱导的MSCs相比,5-aza诱导的MSCs移植并未表现出更多的优越性。