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食品在生产、运输和贮藏过程中易受到微生物污染,导致各类安全事故频发。这些食源性致病菌会降低食品品质,甚至危及人类健康。通常解决这一问题的方法是使用化学防腐剂,但其副作用明显。因此,寻找更加安全可靠的生物来源的化学防腐剂替代品十分迫切和必要。细菌素是核糖体合成的一类具有抑菌能力的多肽,因其对有害微生物具有抑制作用而备受关注。细菌素可以减少食源性疾病传播的风险,延长产品的保质期。使用细菌素代替化学防腐剂对受体的不良影响较小,因为它们易于被蛋白酶水解,并且分解产物无毒无害。最重要的是,细菌素可通过多种方式杀死细菌,而不易使目标细菌产生耐药性。随着社会的发展,科技的进步,更多的新型细菌素将被发现。但传统的细菌素分离纯化方法耗时长,不确定性高。并且由于细菌素种类繁多,性质差异明显,因此并没有固定的纯化方式,使得获得细菌素的成本较高。所以新型细菌素的发现已从传统的活性筛选方式转变为基因组数据分析的方式,以消除遗漏的隐患,使科研人员可以更有效、更方便地大规模挖掘细菌素。四川泡菜是中国传统食品,特别是在川渝地区被广泛食用。本研究中所使用的鼠李糖乳杆菌LS-8是从中国传统四川泡菜中分离得到的,之前的研究确定了其胞外分泌蛋白具有良好的抑菌能力,因此将该菌株作为此次研究的重点。本试验通过将基因组和多肽组信息进行整合,在遗传水平上挖掘潜在的细菌素,并在大肠杆菌表达系统中进行异源表达。随后对选定的细菌素进行稳定性及抑菌机制的研究。具体研究内容和主要结果如下:（1）鼠李糖乳杆菌LS-8的生长在模拟口腔消化和胃消化的环境中受到抑制,在小肠消化环境中不受影响,说明该菌株对α-淀粉酶、酸性环境和胃蛋白酶敏感,但对胰蛋白酶和胆盐不敏感。通过硫酸铵饱和度和吸附解吸p H的优化得到抑菌蛋白最佳提取条件（90%饱和度的硫酸铵,吸附p H为5.85,解吸p H为1.95）,并制备蛋白粗样进行质谱检测。经过四个数据库的比对后共匹配到215个无重复的多肽序列,其中使用APD3（抗菌肽数据库）鉴定出25个多肽序列,有21个来源于硫酸铵沉淀法所得蛋白,4个来源于p H吸附解吸法。（2）提取鼠李糖乳杆菌LS-8的基因组DNA,并在Illumina Novaseq平台测序,通过对开放阅读框的功能注释,对蛋白、脂质和糖类水解及利用的分析,对物种进化的研究得出结论:鼠李糖乳杆菌LS-8基因组中有2835个蛋白编码基因,GO（Gene Ontology）注释显示50.04%的基因为三大分类中的生物过程分类,KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）注释显示有96.86%的基因参与了代谢通路,但还有37.21%的蛋白编码基因未得到COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）功能注释。另外,鼠李糖乳杆菌LS-8可利用的营养物质广泛、细胞代谢活跃、环境适应力强。通过对鼠李糖乳杆菌物种进化情况分析可知,其基因组遗传稳定,突变重组的基因少,未发生大规模插入、缺失和倒位等现象。（3）通过anti SMASH和BAGEL4挖掘软件对鼠李糖乳杆菌LS-8基因组序列进行分析,发现了5个与细菌素相关的基因簇。随后将未标注功能的多肽序列与基因组比对,挖掘出16个潜在细菌素序列。使用Ex PASy对这些序列的理化性质进行预测,序列分子量从7840.41 Da到49323.06 Da不等。除p H4和S75外,其他序列稳定性良好。在使用Prot Scale预测序列亲疏水性时发现S81和S137具有强疏水性。而TMpred预测的穿膜结构显示S68,S81,S109和S137有较强的穿膜能力。所有序列中仅有四个序列存在信号肽。二级结构和三级结构预测到仅p H25中不含有α螺旋结构。S81和S137中BFP<0的比例最高,说明这两个序列的稳定性较好。（4）使用大肠杆菌BL21（DE3）表达系统对16个潜在细菌素序列进行异源表达并制备蛋白粗样。以大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923为指示菌验证其中14个序列的表达蛋白具有抑菌活性,这些序列分别是p H4、p H23、p H25、p H35、p H45、S7、S58、S68、S75、S79、S81、S93、S109和S137。从中选择p H25、S68、S81和S137四个细菌素作为后期研究的重点,并对它们进行表达条件的优化,最终优化条件分别为0.6 mg/m L Kana,OD600=0.45,116.81μg/m L IPTG;0.8 mg/m L Kana,OD600=0.40,95.32μg/m L IPTG;0.6 mg/m L Kana,OD600=0.35,71.49μg/m L IPTG和0.6 mg/m L Kana,OD600=0.40,95.32μg/m L IPTG。通过对19种革兰氏阴性菌（G-）和10种革兰氏阳性菌（G+）的抑菌试验可知这四个序列具有广谱抑菌性,且对革兰氏阴性菌的效果好于革兰氏阳性菌。（5）通过透析、阳离子交换色谱法、反相高效液相色谱法对四个细菌素进行纯化,在液相谱图中收集有抑菌能力的单峰,并冻干浓缩后进行LC-MS/MS鉴定,从多肽片段覆盖度可知抑菌蛋白已成功克隆表达,并得到了较为完整且纯度较高的细菌素蛋白。纯化后四个细菌素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌的MIC范围是5.38到19.84μg/ml。傅里叶变换红外光谱显示四个细菌素均为含有不饱和键的蛋白质,其中p H25含有芳香环,S68具有芳基酮,S81的结构中出现了不饱和C=C双键,而S137存在炔烃结构。使用3×MIC的细菌素处理致病菌48 h内菌体无生长迹象,说明四个细菌素都具有强效抑菌甚至杀菌作用。另外,四个细菌素对于表达载体具有自我杀灭能力,其中p H25抑制表达载体生长的能力最差,S137最强。（6）四个细菌素（p H25、S68、S81和S137）对紫外照射及温度变化均不敏感。抑菌能力在酸性和中性条件下不会受到影响,在碱性条件下略有降低,其中S68的活性丧失最为明显。四个细菌素对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感。3%Na Cl和Fe2+会对p H25的抑菌能力存在影响。S81对Ca2+敏感,而Zn2+、Mn2+、甲醇、丙酮和SDS均会破坏四个细菌素的稳定性。Tween-20和Tween-40会降低p H25抑制金黄色葡萄球菌的能力,但正丁醇可增强p H25的抑菌效果。p H25对VC敏感,而VE会对S137的稳定性造成影响。S137在各种低温环境下都能展现良好的稳定性。根据稳定性试验结果,可将四个新型细菌素的整体稳定性进行排序:p H25<S68<S81<S137。（7）细菌素在2×MIC下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌均表现出杀菌作用,且细菌素对于大肠杆菌具有更好的抑菌能力。在32×MIC浓度下,S68和S137分别出现了13.93%和20.37%的溶血率。通过膜电势差、AO/EB荧光染色及DNA泄露试验发现细菌素p H25和S81对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜均具有破坏能力,S68对这两种致病菌的细胞膜完整性无影响,而S137对大肠杆菌无破膜作用,但会对金黄色葡萄球菌的细胞膜形成破坏。扫描电镜和透射电镜的结果表明,细菌素p H25会增强大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的通透性,使内容物流出引发细胞死亡。S68阻遏了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌DNA或细胞质生成或修复,导致细胞死亡。S81可以直接引发大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的破裂。S137会引起G+菌细胞膜破损,而对G-菌的杀菌机制可能主要发生在胞内。（8）在新鲜牛肉和牛奶中加入大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合菌液及终浓度为2×MIC的细菌素p H25、S68、S81和S137,通过平板计数法观察7 d内食物中致病菌的生长状况,发现p H25和S68对于牛肉中致病菌的抑制效果不显著,但对牛奶中的致病菌有较好的杀菌作用。随后将四个细菌素分别与Nisin（乳酸链球菌素）混合并作用于牛肉及牛奶中,观察到S81+Nisin和S137+Nisin对试验组牛肉中的致病菌展现出明显的联合作用。而将p H25与Nisin一起添加进牛奶中之后,细菌素抑菌能力最弱。