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目的:(1)承接本课题组前期试验,根据NGF,VEGF基因表达序列,构建靶向NGF,VEGF基因的shRNA真核表达载体质粒。将质粒转化大肠杆菌,扩增后重新提取质粒并转染Acc-M细胞。研究靶向NGF,VEGF基因的shRNA真核表达载体质粒的抑制效果。(2)检测神经生长因子(NGF),血管内皮生长因子(VEG)的受体TrkA,VEGFR2在47例不同病理分型涎腺腺样囊性癌(SACC)患者癌组织中的表达情况,结合47例病例随访资料,研究以上因子受体表达程度的高低与涎腺腺样囊性癌转移复发的相关性。方法:(1)根据NGF,VEGF的基因序列,设计并构建靶向NGF,VEGF基因的shRNA真核表达载体质粒,采用酶切电泳,质粒序列检测等方法检测重组质粒合成情况。(2)将质粒转化DH5a感受态大肠杆菌,扩增后重新提取质粒。采用LipofectamineTM 2000脂质体介导NGF,VEGF基因shRNA质粒转染Acc-M细胞系,RT-PCR,Western-blot检测质粒对NFG,VEGF生长因子的抑制效果。(3)免疫组化方法检测不同病理分型涎腺腺样囊性癌患者癌组织中TrkA,VEGFR2的表达情况。采用德国莱卡病理图像分析仪(DMR+Q550型)进行免疫组化结果分析,结合47例病例随访资料分析研究TrkA,VEGFR2在SACC侵袭,转移复发中的作用。结果:1、采用pGenesil1.1载体构建的靶向NGF,VEGF的shRNA表达载体质粒,成功转化DH5α宿主菌。经测序鉴定,表明序列完全一致。成功构建靶向NGF,VEGF基因的shRNA表达载体质粒。2、采用LipofectamineTM 2000进行脂质体介导NGF,VEGF质粒转染Acc-M细胞72小时内采用RT-PCR,Western blot试验检测转染组抑制效果发现,转染组细胞中NGF,VEGF生长因子的表达显著低于非转染组,阴性对照组及空质粒组。3、TrkA、VEGFR2在SACC组织中的阳性率分别是87.23%(41/47例)和85.1%(40/47例),在是否有神经侵袭、复发以及病理类型是否为实性形或者腺样管状性的患者的组织切片中TrkA和VEGFR2表达率均有不同,且差别有统计学意义(P＜0.05);组织内微血管密度(MVD)计数与VEGFR2的表达率成正相关关系,P＜0.05。MVD在复发组为26.58±2.38,无复发组为19.06±1.39,两者相差显著(P＜0.05);MVD在神经侵袭组为25.14±2.83,在无神经侵袭组为18.81±1.33,两者相差显著(P＜0.05)。结论:1、采用pGenesil1.1载体构建靶向NGF,VEGF的shRNA表达载体质粒能有效抑制腺样囊性癌细胞中NGF,VEGF在mRNA和蛋白水平的表达。2、TrkA、VEGFR2在SACC的侵袭转移中可能具有重要作用,由此推测TrkA、VEGFR2可以作为评价涎腺腺样囊性癌患者预后的指标。