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蝎作为生存了四亿多年的古老物种之一,在漫长的进化过程中产生了具有以多肽和蛋白为活性物质的蝎毒液。这些蝎毒液对蝎子捕获猎物和防御天敌起着重要的作用。蝎毒液的活性物质一般是由20-80个氨基酸组成,大多数能与细胞膜上的离子通道结合,据报道当前有100000多种蝎毒肽,它们能与将近350种的膜通道亚型相互作用,其中最为人们清楚的是钠、钾、钙、氯离子通道。离子通道是细胞不停地进行新陈代谢活动,不断和外部环境进行物质和能量交换的中间桥梁。当编码离子通道的基因发生突变或表达异常时,会使通道的功能出现不同程度的削弱或增强,使之无法调节细胞膜的兴奋性和转运膜内外多种离子,从而导致机体整体生理功能的紊乱,出现离子通道疾病。由于离子通道疾病的出现近年来离子通道也成为药物研究的新靶标。在众多离子通道中钾离子通道是目前发现种类最多,作用最复杂的离子通道。钾离子通道存在绝大多数动植物甚至是单细胞的原核生物中,它在生理活动中行使着重要的功能,当编码钾离子通道的基因发生基因突变或者蛋白结构异常则会导致钾离子通道疾病发生。现已发现的钾离子通道的疾病与神经、心脏和肌肉等器官有关。本文研究的内容与Kv1.3钾通道相关的自身免疫疾病有联系。研究表明当人体发生自身免疫反应时会有大量的T细胞激活、增殖和分化,而T细胞表面Kv1.3钾通道数目的激增与自身免疫疾病密切相关。因此Kv1.3通道就成为了治疗自身免疫疾病的新靶标。寻找特异性选择性的Kv1.3钾通道抑制剂就成了当前治疗自身免疫疾病医药的热点。 本文从海南斑等蝎的毒腺组织cDNA文库,分离到蝎毒肽Im58基因,其包含一个180bp的开放阅读框(ORF),编码60个氨基酸,包括22个残基的信号肽和38个残基的成熟肽。Im58多肽的二级结构是由一个α螺旋和3个β折叠通过3对二硫键连接构成。根据Im58多肽的cDNA序列,通过overlapPCR扩增得到Im58目的序列。然后经过酶切和连接转化成功构建蝎毒肽Im58的重组表达载体pGEX-4T-1-Im58,提取重组质粒转化入大肠杆菌E.coli/Rosetta(DE3),用IPTG诱导表达GST-Im58融合蛋白。运用GSH柱亲和层析纯化GST-Im58融合蛋白,然后超滤脱盐浓缩,利用小肠激酶(EK酶)酶切GST-Im58融合蛋白,最后采用RP-HPLC分离纯化Im58多肽,获得色谱纯Im58多肽,利用MALDI-TOF-MS测定其分子量。 利用大肠杆菌表达技术获得Im58多肽后,采用电生理实验测定Im58对电压门控钾通道Kv1.2和Kv1.3的活性。结果表明,100nM左右的Im58多肽只能阻断大约30％的Kv1.2通道电流,而10nM左右的Im58多肽能明显的阻断超过半数Kv1.3通道电流,半数抑制浓度IC50值为2.3±0.83nM。Im58多肽对Kv1.3通道的良好抑制性,表明了Im58多肽能成为一个新型的Kv1.3通道阻断剂,为自身免疫疾病医药的开发提供了一个新的希望。 为了弄清Im58与Kv1.3通道的作用机制,本文利用SWISS-MODEL模拟了Im58的3D结构,也通过在线Blast比对了Im58与α-KTx家族毒素。结果表明Im58拥有经典的功能二聚体,它是由一个赖氨酸和其相距6?左右的芳香族氨基酸组成。因此Im58最有可能是采用赖氨酸堵孔的方式和Kv1.3通道作用。为了验证这个猜想,今后我们还会继续对Im58进行设计和改造,彻底阐明Im58与Kv1.3通道相互作用的分子机制。