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研究背景：
眼睛是人体最重要的感觉器官。不同于身体其他器官，视觉器官需要特殊的形态结构和精细的尺寸调控，以便光线得以聚焦在视网膜黄斑区，形成清晰的图像。视杯（optic cup，OC）是胚眼早期发育中形成的重要组织结构，视杯的形态发生中的任何异常都会导致严重的眼病，如无眼畸形、小眼球综合征和眼先天性缺损。神经视网膜（neural retina，NR）的内陷（invagination）是视杯形态形成过程中最关键的步骤，它包括三个连续的局部过程即：神经视网膜的松弛、睫状缘细胞顶端收缩和神经视网膜组织的扩张。组织生物力学的改变是组织形变的根本原因，其中细胞增殖提供的组织张力和细胞局部收缩提供的收缩力是组织生物力学的核心。视杯形态形成的三个局部过程均发生在视泡原始视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）与原始神经视网膜交界区，即所谓的睫状缘区（ciliary marginal zone）。关于睫状缘区细胞是否参与视杯的形态形成及其参与生物力学调控的细胞及分子机制并不清楚。cKit表面抗原，也称为SCFR或CD117，作为介导胞外信号的细胞膜受体，在胚眼早期发育起始，就已经在视网膜有一定水平的表达。体外条件下，视网膜睫状上皮（ciliary epithelium，CE）神经干细胞中cKit表达上调，提示cKit介导的信号转导可能是神经视网膜干细胞行为的调控机制之一。但是，cKit在胚眼发育的生理和病理过程中的具体功能与调控机制并不清楚。
研究目标：
1.认识cKit及其配体SCF在hESC来源3D视杯发育中的表达与分布，尤其是其与睫状缘的关系；2.研究SCF/cKit信号通路在hESC来源3D视杯发育中的生物学功能及机制；3.研究SCF/cKit信号通路在眼发育性疾病病理过程中的生物学功能及机制。
研究假设：
SCF/cKit信号通路在hESC来源3D视杯发育过程中发挥了重要作用：SCF/cKit信号通过调节hESC来源3D视杯睫状缘区视网膜干/祖细胞的细胞增殖周期，改变睫状缘组织生物力学，促进视杯形态形成。在病理环境压力下，SCF/cKit信号通路的激活能够保护神经视网膜细胞的增殖和迁移，维持神经视网膜正常发育。
研究方案：
1、利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）诱导体外3D视杯，模拟人胚眼早期发育过程，研究cKit及其配体SCF在hESCs来源3D视杯的表达特征；2、药理学调控SCF/cKit信号通路，研究SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯的形态形成和神经发生中的功能和机制；3、利用乙醇和hESCs来源3D视杯建立酒精胚胎综合征眼发育畸形疾病模型，研究SCF/cKit信号通路的调控在胚胎酒精综合征眼发育畸形疾病病理过程中的功能及机制。
研究意义：
阐述SCF/cKit信号通路在胚眼发育的生理与病理过程中的功能与机制，完善胚眼早期发育中形态形成和神经发生的调控机制，为眼发育性疾病的早期诊断、治疗和研究提供理论基础。
研究方法：
根据不同的研究目标，本课题研究方法分为以下三部分。
第一部分：本部分实验拟首先利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）诱导体外3D视杯的自发形成。利用免疫荧光染色和RT-PCR检测胚眼早期发育特异性基因的表达，利用免疫荧光染色和双光子显微镜活体钙成像技术考察睫状缘区组织形态、细胞多样性和干细胞相关的特征性钙离子发放频谱，验证hESCs来源3D视杯模拟人胚眼早期发育的可靠性，考察hESCs来源3D视杯中睫状缘的组织与细胞特性。
第二部分：本部分实验首先利用免疫荧光染色研究cKit及其配体SCF在hESCs来源3D视杯多个发育时间点的空间表达特征，重点其在睫状缘区域的表达特点。通过cKit激活型配体SCF和特异性抑制剂isck03药理学调控SCF/cKit信号通路，利用形态测量、BrdU标记示踪和免疫荧光染色的方法研究SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯的形态形成和神经发生中的功能和机制。
第三部分：本部分实验利用乙醇和hESCs来源3D视杯建立酒精胚胎综合征眼发育畸形疾病模型，通过免疫荧光染色和双光子显微镜活体钙成像技术研究该疾病模型的病理过程，并结合药理学干预研究SCF/cKit信号通路的调控在胚胎酒精综合征眼发育畸形疾病病理过程中的功能及机制。
研究结果：
根据不同的研究实验，本课题研究结果分为以下三部分。
第一部分：hESCs来源3D视杯具有典型的神经视网膜与视网膜色素上皮的视杯样结构，且表达视网膜发育特异性基因如Rax、Chx10、Pax6和MITF等，可以很好模拟人胚眼早期发育。同时，hESCs来源3D视杯能发育出具有典型的长楔形形态的睫状缘结构，并阳性表达人睫状缘特异性分子标志SSEA1。hESCs来源3D视杯的睫状缘区视网膜干/祖细胞可以进一步划分为Chx10+Sox2-细胞和Chx10+Sox2+细胞两个细胞亚群。另外，hESCs来源3D视杯的睫状缘区视网膜干/祖细胞的钙离子发放主要呈全细胞一过性高幅值钙波和细胞局部的低幅值高频率钙波。之前的研究称这两种特征性钙波分别与神经发生中的往返运动性细胞核迁移（interkinetic nuclear migration,INM）和干细胞的增殖分化相关。
第二部分：在hESCs来源3D视杯诱导第24天，cKit特异性表达分布于hESCs来源3D视杯神经视网膜，并在睫状缘中高表达，至诱导第30天其表达逐渐局限于睫状缘区，并至诱导第45天失去表达。SCF的表达主要分布于神经视网膜内层底端和视网膜色素上皮。SCF/cKit信号通路的激活能够提高hESCs来源3D视杯睫状缘区视网膜干细胞/祖细胞的BrdU摄取率和稀释率，增加细胞增殖速率，促进睫状缘视网膜干/祖细胞的细胞周期进展，从而增强细胞增殖提供的切线张力，加速神经视网膜内凹折叠形成视杯形态。SCF/cKit信号通路的激活能够增强hESCs来源3D视杯睫状缘区顶端pMLC活性，产生细胞顶端张力以产生朝向视网膜色素上皮的拉力；同时SCF/cKit信号通路的激活还能促进细胞骨架F-actin解聚，降低组织刚性以利于神经视网膜发生形变，促进视杯形态形成。SCF/cKit信号通路的激活促进了hESCs来源3D视杯中央部神经视网膜幼稚神经节细胞的迁移和成熟，减少了发育中的细胞凋亡。SCF/cKit信号通路的紊乱还能促使视网膜终末细胞提前分化，影响了视网膜祖细胞的命运选择及定向分化。
第三部分：1%乙醇浓度导致hESCs来源3D视杯神经视网膜的厚度明显变薄，降低了3D视杯组织生长速率；显著增加了hESCs来源3D视杯神经视网膜细胞凋亡，减少了Ki67+增殖细胞数量；阻碍了幼稚神经节细胞的迁移和成熟，导致神经上皮底端神经节细胞Tuj1信号完全缺失；减弱了细胞增殖相关的一过性全细胞钙波，增加了细胞凋亡相关的细胞局部钙波，有效模拟了胚胎酒精综合征的眼发育畸形病理发生。SCF/cKit信号通路的激活可以减少酒精胚胎综合征眼发育畸形病理模型中的细胞凋亡，逆转神经节细胞迁移障碍，促进幼稚神经节细胞在神经视网膜内层的正常分布，维持hESCs来源3D视杯神经视网膜的正常组织发育。
研究结论：
1、本研究首次揭示了：hESCs来源3D视杯中的睫状缘细胞通过SCF/cKit信号通路的调控参与了视杯的形态形成。创新性利用慢病毒Lenti-CMV-GCaMP5G构建了表达遗传编码的钙指示剂GCaMP5G的人胚胎干细胞系H1-GCaMP5G，由此发现hESCs来源3D视杯中睫状缘区视网膜干/祖细胞具备一定的细胞多样性，具有与神经干细胞相关的钙离子发放频谱。
2、本研究明确了：hESCs来源3D视杯诱导第30天，cKit的高表达局限于其睫状缘区，并随着发育进行其表达逐渐消失。因此，hESCs来源3D视杯诱导第30天时，其cKit+细胞可以按照cKit表达强度可以分为两类：位于周边部神经视网膜的cKit+strong睫状缘区视网膜干/祖细胞，和位于中央部神经视网膜内层的cKit+dim视网膜祖细胞。
3、本研究首次阐述了：SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯发育中，能够调控睫状缘干/祖细胞的周期进展，调节睫状缘区细胞顶端张力，改变局部细胞系统动力学，促进神经视网膜内陷和形变，加速视杯的形态形成。另外，SCF/cKit信号还能调控hESCs来源3D视杯神经视网膜中幼稚的神经节细胞迁移，调控神经视网膜细胞凋亡，影响视网膜祖细胞命运，调控视网膜神经发生。
4、本课题率先报道了：在胚眼发育性疾病的病理过程中，比如孕期饮酒导致的胚胎酒精综合征眼发育畸形，hESCs来源3D视杯SCF/cKit信号通路的激活可以减少神经视网膜细胞凋亡，逆转幼稚神经节细胞的迁移障碍，帮助胚胎视网膜组织应对病理因素的压力，维持神经视网膜正常的组织生长和神经发生。为胚胎酒精综合征眼发育畸形的诊治和研究提供了新的思路。
眼睛是人体最重要的感觉器官。不同于身体其他器官，视觉器官需要特殊的形态结构和精细的尺寸调控，以便光线得以聚焦在视网膜黄斑区，形成清晰的图像。视杯（optic cup，OC）是胚眼早期发育中形成的重要组织结构，视杯的形态发生中的任何异常都会导致严重的眼病，如无眼畸形、小眼球综合征和眼先天性缺损。神经视网膜（neural retina，NR）的内陷（invagination）是视杯形态形成过程中最关键的步骤，它包括三个连续的局部过程即：神经视网膜的松弛、睫状缘细胞顶端收缩和神经视网膜组织的扩张。组织生物力学的改变是组织形变的根本原因，其中细胞增殖提供的组织张力和细胞局部收缩提供的收缩力是组织生物力学的核心。视杯形态形成的三个局部过程均发生在视泡原始视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）与原始神经视网膜交界区，即所谓的睫状缘区（ciliary marginal zone）。关于睫状缘区细胞是否参与视杯的形态形成及其参与生物力学调控的细胞及分子机制并不清楚。cKit表面抗原，也称为SCFR或CD117，作为介导胞外信号的细胞膜受体，在胚眼早期发育起始，就已经在视网膜有一定水平的表达。体外条件下，视网膜睫状上皮（ciliary epithelium，CE）神经干细胞中cKit表达上调，提示cKit介导的信号转导可能是神经视网膜干细胞行为的调控机制之一。但是，cKit在胚眼发育的生理和病理过程中的具体功能与调控机制并不清楚。
研究目标：
1.认识cKit及其配体SCF在hESC来源3D视杯发育中的表达与分布，尤其是其与睫状缘的关系；2.研究SCF/cKit信号通路在hESC来源3D视杯发育中的生物学功能及机制；3.研究SCF/cKit信号通路在眼发育性疾病病理过程中的生物学功能及机制。
研究假设：
SCF/cKit信号通路在hESC来源3D视杯发育过程中发挥了重要作用：SCF/cKit信号通过调节hESC来源3D视杯睫状缘区视网膜干/祖细胞的细胞增殖周期，改变睫状缘组织生物力学，促进视杯形态形成。在病理环境压力下，SCF/cKit信号通路的激活能够保护神经视网膜细胞的增殖和迁移，维持神经视网膜正常发育。
研究方案：
1、利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）诱导体外3D视杯，模拟人胚眼早期发育过程，研究cKit及其配体SCF在hESCs来源3D视杯的表达特征；2、药理学调控SCF/cKit信号通路，研究SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯的形态形成和神经发生中的功能和机制；3、利用乙醇和hESCs来源3D视杯建立酒精胚胎综合征眼发育畸形疾病模型，研究SCF/cKit信号通路的调控在胚胎酒精综合征眼发育畸形疾病病理过程中的功能及机制。
研究意义：
阐述SCF/cKit信号通路在胚眼发育的生理与病理过程中的功能与机制，完善胚眼早期发育中形态形成和神经发生的调控机制，为眼发育性疾病的早期诊断、治疗和研究提供理论基础。
研究方法：
根据不同的研究目标，本课题研究方法分为以下三部分。
第一部分：本部分实验拟首先利用人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）诱导体外3D视杯的自发形成。利用免疫荧光染色和RT-PCR检测胚眼早期发育特异性基因的表达，利用免疫荧光染色和双光子显微镜活体钙成像技术考察睫状缘区组织形态、细胞多样性和干细胞相关的特征性钙离子发放频谱，验证hESCs来源3D视杯模拟人胚眼早期发育的可靠性，考察hESCs来源3D视杯中睫状缘的组织与细胞特性。
第二部分：本部分实验首先利用免疫荧光染色研究cKit及其配体SCF在hESCs来源3D视杯多个发育时间点的空间表达特征，重点其在睫状缘区域的表达特点。通过cKit激活型配体SCF和特异性抑制剂isck03药理学调控SCF/cKit信号通路，利用形态测量、BrdU标记示踪和免疫荧光染色的方法研究SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯的形态形成和神经发生中的功能和机制。
第三部分：本部分实验利用乙醇和hESCs来源3D视杯建立酒精胚胎综合征眼发育畸形疾病模型，通过免疫荧光染色和双光子显微镜活体钙成像技术研究该疾病模型的病理过程，并结合药理学干预研究SCF/cKit信号通路的调控在胚胎酒精综合征眼发育畸形疾病病理过程中的功能及机制。
研究结果：
根据不同的研究实验，本课题研究结果分为以下三部分。
第一部分：hESCs来源3D视杯具有典型的神经视网膜与视网膜色素上皮的视杯样结构，且表达视网膜发育特异性基因如Rax、Chx10、Pax6和MITF等，可以很好模拟人胚眼早期发育。同时，hESCs来源3D视杯能发育出具有典型的长楔形形态的睫状缘结构，并阳性表达人睫状缘特异性分子标志SSEA1。hESCs来源3D视杯的睫状缘区视网膜干/祖细胞可以进一步划分为Chx10+Sox2-细胞和Chx10+Sox2+细胞两个细胞亚群。另外，hESCs来源3D视杯的睫状缘区视网膜干/祖细胞的钙离子发放主要呈全细胞一过性高幅值钙波和细胞局部的低幅值高频率钙波。之前的研究称这两种特征性钙波分别与神经发生中的往返运动性细胞核迁移（interkinetic nuclear migration,INM）和干细胞的增殖分化相关。
第二部分：在hESCs来源3D视杯诱导第24天，cKit特异性表达分布于hESCs来源3D视杯神经视网膜，并在睫状缘中高表达，至诱导第30天其表达逐渐局限于睫状缘区，并至诱导第45天失去表达。SCF的表达主要分布于神经视网膜内层底端和视网膜色素上皮。SCF/cKit信号通路的激活能够提高hESCs来源3D视杯睫状缘区视网膜干细胞/祖细胞的BrdU摄取率和稀释率，增加细胞增殖速率，促进睫状缘视网膜干/祖细胞的细胞周期进展，从而增强细胞增殖提供的切线张力，加速神经视网膜内凹折叠形成视杯形态。SCF/cKit信号通路的激活能够增强hESCs来源3D视杯睫状缘区顶端pMLC活性，产生细胞顶端张力以产生朝向视网膜色素上皮的拉力；同时SCF/cKit信号通路的激活还能促进细胞骨架F-actin解聚，降低组织刚性以利于神经视网膜发生形变，促进视杯形态形成。SCF/cKit信号通路的激活促进了hESCs来源3D视杯中央部神经视网膜幼稚神经节细胞的迁移和成熟，减少了发育中的细胞凋亡。SCF/cKit信号通路的紊乱还能促使视网膜终末细胞提前分化，影响了视网膜祖细胞的命运选择及定向分化。
第三部分：1%乙醇浓度导致hESCs来源3D视杯神经视网膜的厚度明显变薄，降低了3D视杯组织生长速率；显著增加了hESCs来源3D视杯神经视网膜细胞凋亡，减少了Ki67+增殖细胞数量；阻碍了幼稚神经节细胞的迁移和成熟，导致神经上皮底端神经节细胞Tuj1信号完全缺失；减弱了细胞增殖相关的一过性全细胞钙波，增加了细胞凋亡相关的细胞局部钙波，有效模拟了胚胎酒精综合征的眼发育畸形病理发生。SCF/cKit信号通路的激活可以减少酒精胚胎综合征眼发育畸形病理模型中的细胞凋亡，逆转神经节细胞迁移障碍，促进幼稚神经节细胞在神经视网膜内层的正常分布，维持hESCs来源3D视杯神经视网膜的正常组织发育。
研究结论：
1、本研究首次揭示了：hESCs来源3D视杯中的睫状缘细胞通过SCF/cKit信号通路的调控参与了视杯的形态形成。创新性利用慢病毒Lenti-CMV-GCaMP5G构建了表达遗传编码的钙指示剂GCaMP5G的人胚胎干细胞系H1-GCaMP5G，由此发现hESCs来源3D视杯中睫状缘区视网膜干/祖细胞具备一定的细胞多样性，具有与神经干细胞相关的钙离子发放频谱。
2、本研究明确了：hESCs来源3D视杯诱导第30天，cKit的高表达局限于其睫状缘区，并随着发育进行其表达逐渐消失。因此，hESCs来源3D视杯诱导第30天时，其cKit+细胞可以按照cKit表达强度可以分为两类：位于周边部神经视网膜的cKit+strong睫状缘区视网膜干/祖细胞，和位于中央部神经视网膜内层的cKit+dim视网膜祖细胞。
3、本研究首次阐述了：SCF/cKit信号通路在hESCs来源3D视杯发育中，能够调控睫状缘干/祖细胞的周期进展，调节睫状缘区细胞顶端张力，改变局部细胞系统动力学，促进神经视网膜内陷和形变，加速视杯的形态形成。另外，SCF/cKit信号还能调控hESCs来源3D视杯神经视网膜中幼稚的神经节细胞迁移，调控神经视网膜细胞凋亡，影响视网膜祖细胞命运，调控视网膜神经发生。
4、本课题率先报道了：在胚眼发育性疾病的病理过程中，比如孕期饮酒导致的胚胎酒精综合征眼发育畸形，hESCs来源3D视杯SCF/cKit信号通路的激活可以减少神经视网膜细胞凋亡，逆转幼稚神经节细胞的迁移障碍，帮助胚胎视网膜组织应对病理因素的压力，维持神经视网膜正常的组织生长和神经发生。为胚胎酒精综合征眼发育畸形的诊治和研究提供了新的思路。