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目的:建立SD大鼠海马神经元细胞原代培养模型,确定最适的高糖作用浓度和作用时间;检测高糖作用下海马神经元细胞内ERK、p-ERK和MLCK的表达;探讨高糖环境下海马神经元细胞MLCK与MAPK/ERK信号通路的相关性;初步研究高糖作用后二苯乙烯苷致MLCK表达下降的作用机制。方法:1.海马神经元细胞的原代培养及鉴定:以25mM为基础糖浓度培养海马神经元细胞,并用倒置显微镜观察海马神经元的形态;细胞培养至第7天,通过NSE免疫组化染色鉴定海马神经元细胞的纯度,并计算海马神经元细胞的纯度;2.最适高糖浓度探索:原代培养海马神经元细胞,将细胞悬液接种到96孔板中,细胞培养至第5天,将细胞分为25mM-24h组、25mM-48h组、25mM-72h组、45hmM-24h组、45mM-48h组、45mM-72h组;达到各组相应的糖作用时间后,用CCK-8试剂盒检测各组细胞的OD值,计算各组海马神经元的活性,得出最适高糖作用浓度。3.最适高糖作用时间的探索:原代培养海马神经元细胞,将细胞悬液接种到玻底培养皿中,将细胞分为25mM组、45hmM-24h组、45mM-48h组、45mM-72h组;达到各组相应的糖作用时间后,进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察海马神经元ERK、p-ERK和MLCK的表达,得出最适高糖作用时间。4.高糖作用后,海马神经元细胞内ERK、p-ERK和MLCK的表达情况:原代培养海马神经元细胞,细胞培养至第5天,将细胞分为对照组和高糖组;达到高糖作用的48h后,提取蛋白,BCA蛋白定量后,Western Blot检测ERK、p-ERK和MLCK的表达,并进行统计学分析。5.p-ERK和MLCK相关性的探讨:原代培养海马神经元细胞,细胞培养至第5天,将细胞分为高糖对照组、ERK抑制剂组和MLCK抑制剂组;其中ERK抑制剂组在高糖作用的同时加入ERK抑制剂PD98059作用24h,MLCK抑制剂组在高糖作用的同时加入MLCK抑制剂作用8h;高糖作用48h后,提取蛋白,BCA蛋白定量后,Western Blot检测p-ERK和MLCK的表达,并进行统计学分析。6.二苯乙烯苷对海马神经元细胞的保护作用:原代培养海马神经元细胞,细胞培养至第5天,将细胞分为高对照组糖组、二苯乙烯苷低剂量组(TSG-L组TSG浓度为10μmol/L)、二苯乙烯苷中剂量组(TSG-M组,TSG浓度为50μmol/L)和二苯乙烯苷高剂量组(TSG-H组,TSG浓度为100μmol/L);各组在高糖作用的同时加入相应浓度的二苯乙烯苷作用24h;高糖作用48h后,提取蛋白,BCA蛋白定量后,Western Blot检测各组海马神经元中p-ERK和MLCK的表达,并进行统计学分析。结果:1.海马神经元细胞的原代培养及鉴定:海马神经元细胞接种后6h完全贴壁,生长良好,至7天基本发育成熟,经鉴NSE染色鉴定细胞纯度达90%以上,适合后续实验。2.最适高糖浓度的探索:CCK-8结果显示45mM组培养24h、48h、72h的海马神经元存活率>80%,属1级细胞,可用于后续试验;60mM组培养24h、48h和72h后,海马神经元存活率均<80%,不能用于后续试验。3.最适高糖作用时间的探索:激光共聚焦观察海马神经元发现,随着糖浓度的升高,海马神经元细胞内ERK荧光强度不变(P>0.05),p-ERK和MLCK荧光强度均升高(P<0.05),45mM-48h和45mM-72h组较45mM-24h组升高明显(P<0.05),但45mM-48h组和45mM-72h组差异没有统计学意义(P>0.05)。4.高糖作用后,海马神经元细胞内p-ERK和MLCK的表达情况:Western Blot结果显示,与对照组相比,ERK表达无明显变化(P>0.05),高糖组海马神经元细胞内p-ERK和MLCK表达明显升高(P<0.01);5.高糖作用下,p-ERK与MLCK的关系探讨:Western Blot结果显示,与高糖组相比,MLCK抑制剂组MLCK表达降低(P<0.01),但p-ERK水平未有明显变化(P>0.05);PD组MLCK表达及p-ERK水平均降低(P<0.01),且两者具有正相关性(r=0.878,P<0.01);6.二苯乙烯苷对海马神经元细胞的保护作用:Western Blot结果显示,TSG-M组、TSG-H组MLCK表达及p-ERK表达均降低(P<0.05),MLCK表达与p-ERK变化水平呈正相关(r=0.829,P<0.01)。TSG-L组MLCK和p-ERK表达虽降低但差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:1.糖浓度升高时海马神经元细胞内ERK表达没有变化,但p-ERK水平及MLCK表达增高。2.糖浓度升高引起海马神经元细胞MLCK的表达的变化受MAPK/ERK信号通路的调控。3.二苯乙烯苷可通过MAPK/ERK通路来调节MLCK的表达,从而在糖浓度升高时对海马神经元细胞起到保护作用。