PRV UL54亚细胞定位信号的鉴定及其核质穿梭机制的研究以及与HSV-1皮层蛋白VP22相互作用宿主蛋白的筛选

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangshilei19850715
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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)能够引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病,猪为其自然宿主。该病在猪群中的传播和流行给养殖业造成了巨大的经济损失。UL54基因由1086个核苷酸组成,可编码一个含361个氨基酸分子量约为40kDa的蛋白质UL54。UL54蛋白为PRV三个早期基因表达产物之一,在氨基酸水平,它与Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus1,HSV-1)的即早期蛋白ICP27有41%的同源性。HSV-1ICP27是一个多功能蛋白并且在病毒的感染及复制上起着不可或缺的作用,而且ICP27的功能研究已经较为深入,但UL54的确切功能至今仍尚不清楚。前期研究表明UL54定位于细胞核中,并且含有一个可以结合RNA的RGG基序,但其准确的亚细胞定位信号、定位机制、转运机制及生物学功能尚不清楚。   本研究采用构建UL54与增强型黄色荧光蛋白(EYFP)融合的真核表达质粒转染细胞发现UL54在活细胞内主要呈现核仁定位;通过构建UL54的缺失及定点突变体鉴定了UL54的核仁定位信号(NoLS)和核定位信号(NLS);确定了核定位对于UL54体外调控ICP0蛋白表达中起着重要作用;异源核融合实验证实了UL54是一种核质穿梭蛋白;Ran-GTP显性负突变体、Leptomycin B处理以及免疫共沉淀等实验表明该蛋白通过TAP/NXF1而非CRM1依赖的核输出及依赖于Ran的核输入转运机制;通过构建NLS以及NoLS的单缺失和双缺失病毒,证实了UL54的核输入在病毒复制、增殖和调控病毒基因的表达中起着至关重要的作用,从而为阐明UL54在病毒感染中的生物学功能奠定了基础。此外,我们应用高通量酵母双杂交技术筛选了与HSV-1皮层蛋白VP22相互作用的宿主蛋白,并进一步验证了RNF10和WDR42A与VP22的相互作用。
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