论文部分内容阅读
紫杉醇是由红豆杉属植物产生的一类二萜类化合物，具有独特的抗癌机理，能催化微管蛋白迅速合成微管作用，并可与微管结合，防止微管解聚，从而达到抑制肿瘤细胞生长的作用，目前已经在临床上用于卵巢癌和乳腺癌的治疗。由于红豆杉生长缓慢且紫杉醇产量极低，因此寻找新的紫杉醇药物来源一直是研究的热点所在。随着紫杉醇生物合成途径中关键酶作用机制的逐步阐明，利用代谢工程以及组合生物合成的方法在微生物中异源表达紫杉醇及其前体药物已经成为可能。灵芝和猴头都是大型真菌，都具有独特的天然萜类物质代谢池，理论上适合作为紫杉醇代谢工程的异源宿主。 紫杉二烯合成酶(taxadiene synthase，TS)是紫杉醇生物合成的第一个关键酶，它催化牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)环化生成紫杉二稀(taxa-4(5)，11(12)-diene)，这一步是紫杉醇生物合成途径中的第一个被阐明的步骤。本研究通过PEG介导法将紫杉二烯合成酶基因的表达载体和含潮霉素抗性基因的表达载体共转化灵芝和猴头菌原生质体，利用气质连用色谱法对工程菌株菌丝成分进行初步分析。主要研究结果如下： (1)通过对猴头菌原生质体制备的各种因素进行优化，结果表明了猴头菌原生质体制备的最佳体系为：液体培养5d的猴头菌丝，以0.6 mol/LKCl作为稳渗剂，加入含1.0％纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶璧酶的复合酶，在30℃酶解猴头菌丝3h时，分离得到的原生质体数量最多，达到3.0×106个/ml。 (2)确定了潮霉素对灵芝菌丝的致死浓度为250μg/ml，对灵芝原生质体的致死浓度为100μg/ml；潮霉素对猴头菌菌丝及其原生质体的致死浓度均为60μg/ml； (3)采用PEG介导法，将真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph共转化灵芝原生质体，经潮霉素初步筛选，PCR鉴定，结果表明有4株灵芝转化子的基因组扩增出外源TS基因；RT-PCR结果显示，4株灵芝转化子在mRNA水平上成功转录表达了外源TS基因。拟转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证，结果表明了4个拟转化子中只有一个拟转化子的基因组中稳定整合了TS基因和一个拟转化子的基因组组中稳定整合了hph抗性基因。 (4)采用PEG介导法，将真核表达载体pgGlgpd-TS和pBgGI-hph共转化猴头菌原生质体，经潮霉素初步筛选，PCR鉴定，结果表明有4株猴头菌转化子的基因组扩增出TS基因；RT-PCR结果显示，4株猴头菌转化子在mRNA水平上成功转录表达了外源TS基因；拟转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证，结果表明了4个拟转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因，而TS基因没有稳定整合。