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目的和意义CD24是一种低分子量高度糖基化的粘蛋白样粘附分子,通过糖基磷脂腺肌醇锚定在细胞膜糖脂富集区(glycolipid enriched membrane, GEM)上。研究表明CD24同多种肿瘤发生、发展及预后密切相关,对肿瘤的诊治具有重要意义。本课题组前期工作首次在肿瘤细胞增殖及侵袭转移方面证实CD24参与了结直肠癌的进展过程,但其具体机制尚待明确。近年来,血管生成被认为是肿瘤侵袭转移的关键环节,抗血管生成也成为肿瘤研究热点之一。鉴于此,本研究探讨了CD24在大肠癌血管生成中的作用,并通过明确相互作用蛋白在此过程中的潜在调控机制寻找新的抗癌靶点,为结直肠肿瘤治疗提供新的思路。方法1、CD24在血管生成中的作用1.1用CD24siRNA及其对照Control siRNA处理大肠癌HT29细胞,3天后Western blot检测细胞中CD24的表达；培养24h后,收集上清,特异酶联免疫吸附试剂盒(ELISA kit)检测上清中VEGF的浓度。1.2分别用1.1中收集到的两组细胞上清处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),细胞划痕实验及trans-well小室检测CD24对HUVEC迁移能力的影响；基质胶小管形成实验检测CD24对HUVEC血管生成能力的作用。2、CD24相互作用蛋白的筛选及鉴定2.1构建稳定表达CD24的pcDNA4-CD24-myc质粒,用pcDNA4-CD24-myc及其对照pcDNA4-myc质粒处理HT29细胞,提取总蛋白,以CD24为“诱饵蛋白”,用液相色谱质谱法,通过MALDI-TOF/TOF UltraFlex Ⅱ质谱分析仪,筛选人MSDB数据库中CD24潜在的相互作用蛋白。2.2构建SW480CD24及SW480Vec稳定表达株,PCR及Western blot验证稳定克隆细胞中CD24的表达情况。2.3运用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, co-IP)技术在大肠癌细胞HT29及SW480CD24稳定表达株中验证Hsp90是否为CD24的相互作用蛋白。2.4Western blot检测多种细胞系中CD24与Hsp90的表达情况。2.5用Hsp90的特异性抑制剂17-AAG处理HT29细胞及SW480CD24细胞, Western blot及免疫荧光检测细胞中CD24表达量的改变；加入MG132处理因素研究CD24的降解机制。2.6免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察的方法检测CD24及Hsp90在肠癌细胞中的定位情况。2.7用免疫组织化学染色法检测肠癌组织中CD24及Hsp90的表达情况,分析相关性。3、Hsp90在CD24介导的肠癌细胞血管生成过程中的作用及分子机制3.1Hsp90对CD24介导的肠癌细胞血管生成的影响3.1.1体外实验：用Hsp90的特异性抑制剂17-AAG处理SW480稳定表达株,ELISA试剂盒检测各组上清中VEGF的浓度并比较；分别用各组上清处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),细胞划痕实验及trans-well小室检测CD24及17-AAG对HUVEC迁移能力的影响；基质胶小管形成实验检测CD24对HUVEC血管生成能力的作用。3.1.2体内试验：鸡胚绒毛尿囊膜实验：5日龄受精鸡胚在无菌坏境下经气室端(钝头端)开窗,去除气室膜,暴露鸡胚绒毛尿囊膜(chick embryo chorioallantoic membrane, CAM)。将2×2×2mm3大小的无菌明胶海绵分别浸泡入上述各组细胞上清,浸泡后至于鸡胚绒毛尿囊膜血管稀疏部位,无菌透明胶带封闭气室端,继续在温度为38.5℃到39℃、相对湿度为65%到70%的孵箱中培养。4天后小心去除透明胶带,充分暴露鸡胚绒毛尿囊膜,实体显微镜下观察明胶海绵部位新生血管生成情况。3.2Hsp90调控CD24介导的肠癌细胞血管生成的机制3.2.1CD24调控VEGF表达的初步探索：提高或压低相应细胞中CD24的表达,提取细胞浆及细胞核蛋白,Werstern blot检测STAT3的表达。通过CHIP、qPCR的方法检测SW480CD24细胞中STAT3与VEGF基因启动子区的结合情况。3.2.2对Hsp90α和Hsp90β的初步探索：用免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察的方法进一步观察Hsp90α、Hsp90β、GM1及CD24的细胞定位。使用胞膜脂质筏破坏剂methyl-β-cyclodextrin (M β CD)处理细胞后,密度梯度离心分离出脂质与非脂质成分,Western blot检测Hsp90α、Hsp90β及CD24在不同成分中的表达。4、数据的统计学处理结果均经SPSS13.0软件统计分析。体内及体外实验检测数据均采用均数±标准差(x±SD)表示,在方差齐性的基础上,采用两组间独立样本t检验或多组间one way ANOVA进行统计分析。方差不齐使用Satterthwaite近似t检验或Dunnett’s T3检验。免疫组化染色两分子相关性采用Spearman秩相关检验P<0.05为差异有显著性。结果1、CD24可诱导体外血管生成CD24siRNA处理组HT29细胞上清中分泌的血管内皮生长因子(VEGF)浓度显著低于Control siRNA组(P=0.001)；细胞划痕及trans-well小室实验显示用CD24siRNA处理组细胞上清培养的HUVEC细胞的侵袭能力均低于Control siRNA组(P=0.008；P=0.000)；基质胶小管形成实验显示CD24siRNA上清处理组HUVEC细胞的血管生成能力较对照组显著下降(P=0.013)。2、CD24的相互作用蛋白的筛选及鉴定2.1以CD24为“诱饵蛋白”,挑出11个阳性条带进行气液相色谱质谱测序分析,经人MSDS数据库BLAST对比证实存在8个CD24潜在的相互作用蛋白。其中包括热休克蛋白90(Hsp90),它多以分子伴侣形式参与相关蛋白的折叠、装配、细胞内运输及降解等过程,与肿瘤发生发展、生物学行为及预后有密切关系。2.2CD24与Hsp90在不同细胞系中的表达情况：CD24在肠癌细胞系HT29中高表达,在SW620中中度表达,在SW480、HCT116和Lovo细胞中呈低表达或无表达。Hsp90在上述5种细胞系中表达水平均较高。2.3PCR及WB证实成功构建了SW480CD24及SW480Vec稳定表达株。2.4co-IP实验结果显示,无论内源性(HT29细胞中)还是外源性(SW480CD24细胞中)的CD24均可与Hsp90相互结合。3、CD24是Hsp90的客户蛋白,Hsp90可通过依赖蛋白酶体的途径调节CD24的稳定及降解用Hsp90的特异性抑制剂17-AAG处理HT29细胞及SW480CD24细胞,Western blot及免疫荧光染色显示细胞中CD24表达量明显下降；加入蛋白酶体抑制剂MG132处理后,Western blot显示CD24的降解趋势被逆转,提示17-AAG可通过依赖蛋白酶体的途径促进CD24降解。4、Hsp90促进CD24诱导的大肠癌的血管生成进程4.1CD24与Hsp90共定位于大肠癌HT29细胞及SW480CD24的细胞膜上。在肠癌细胞中对CD24和Hsp90进行免疫荧光共染色显示CD24位于大肠癌细胞HT29及SW480CD24的细胞膜,而Hsp90存在于大肠癌HT29及SW480CD24的细胞膜及细胞浆,两者在肠癌细胞的细胞膜上有明显的共定位。4.2CD24和Hsp90在肠癌组织中均呈高表达,并有相关性。通过对81对肠癌及其邻近正常肠上皮组织进行免疫组织化学染色发现CD24与Hsp90的表达率分别为95.1%(77/81)、98.7%(80/81)。两种蛋白的表达谱相似,在原发肠癌组织中的表达显著高于正常肠上皮组织(p值均<0.001),且Ⅳ期肠癌中的表达显著高于Ⅰ期肠癌(p值均<0.001)。Spearman相关分析得到r=0.560,P=0,000提示两者表达呈正相关。4.3Hsp90可促进CD24诱导的大肠癌的血管生成ELISA显示CD24可刺激大肠癌SW480细胞分泌VEGF(P=0.000),而Hsp90的特异性抑制剂17-AAG却显著抑制CD24诱导的VEGF的分泌(P=0.000)。划痕实验及trans-well小室实验提示与对照组SW480Vec细胞相比,SW480CD24细胞分泌的上清可刺激HUVEC细胞的迁移侵袭能力(P=0.000；P=0.001)；而17-AAG处理组则明显逆转了CD24诱导的HUVEC细胞的迁移侵袭趋势(P=0.000；P=0.002)。小管形成实验提示与对照组SW480Vec细胞相比,SW480CD24细胞分泌的上清可刺激HUVEC细胞形成小管的能力(P=0.009),17-AAG处理组可明显逆转这一趋势(P=0.011)。鸡胚绒毛尿囊膜实验显示与对照组SW480Vec细胞相比,SW480CD24细胞分泌的上清可刺激绒毛尿膜囊形成新生血管的能力(P=0.000),17-AAG处理组则抑制了CD24诱导的绒毛尿膜囊的血管生成(P=0.000)。4.4Hsp90促进CD24诱导的大肠癌的血管生成的机制研究4.4.1CD24可促进STAT3发生核转位：SW480细胞中提高CD24的表达引起STAT3从细胞浆转移至细胞核,而HT29细胞中压低CD24的表达使STAT3从细胞核转移至细胞浆。4.4.2STAT3是CD24上调VEGF表达的必要条件：与对照组相比(SW480vec)在SW480CD24细胞中STAT3抗体处理组出现了更亮的长130bp的目的条带,而无关IgG处理组没有；SW480CD24细胞中STAT3抗体处理组VEGF的量较SW480vec组显著增高,p<0.01。4.4.3Hsp90α与CD24共定位于大肠癌HT29细胞膜的脂质筏上：对HT29细胞进行免疫荧光共染色,发现部分Hsp90α、CD24与脂质筏标记GM1在细胞膜上有共定位,而Hsp90β只存在细胞浆中,与CD24无共定位。用胞膜脂质筏破坏剂nethyl-β-cyclodextrin (Mβ CD)处理HT29细胞,密度梯度离心分离出脂质与非脂质成分,Western blot检测发现Hsp90α与CD24在脂质成分中的表达趋势一致,而Hsp90β只存在于非脂质成分中。结论综合以上研究结果,我们可以得出如下结论：1、CD24可刺激大肠癌细胞VEGF的分泌,在体外诱导血管生成。2、Hsp90是CD24结合蛋白,可以通过依赖蛋白酶体的途径调节CD24的降解。3、Hsp90可调控CD24诱导的大肠癌血管生成过程。4、CD24可促进STAT3核转位,进而调节VEGF的表达。5、Hsp90α与CD24共定位于细胞膜脂质筏,可能在调控过程中起主导作用。