论文部分内容阅读
[背景及目的]进行性肝纤维化(liver fibrosis)是各种慢性肝病演变为肝硬化的主要发病机制,造成细胞外基质过度沉积,功能性肝细胞相对减少,尤其是肝损伤后功能性肝细胞减少,使得补充丢失的肝细胞已成为近年来研究的热点。干细胞移植是当今世界上最前沿、最热门的医疗新技术之一。国内外的研究及临床应用均表明,自体干细胞移植治疗肝硬化腹水等肝病疗效肯定,具有较好推广价值,被誉为“肝硬化治疗第二条终极途径”骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是来源于中胚层具有多向分化能力的干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富。BMSCs在一定的诱导条件下能分化为神经细胞、成骨细胞、造血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、表皮细胞、腱细胞、脂肪细胞、肝细胞等。BMSCs具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,且低免疫源性,具有在活体内外诱导分化为肝细胞的潜能,动物实验及临床初步研究显示移植自身BMSCs可改善肝功能,有望成为新的肝细胞源治疗肝脏疾病。BMSCs的导入途径是影响干细胞定植于肝脏的重要因素。门静脉或肝动脉介入肝脏或脾脏内BMSCs移植是临床上应用较多的途径,但受到仪器设备、操作技术、患者病情影响,上述途径的采用受到一定影响,而常规经外周静脉移植BMSCs,干细胞在肝脏定植少。理想的移植途径应是创伤小、操作方便、定植率高。菲立磁(Feridex)具有磁靶向性,在外磁场的作用下,可定向聚集于靶器官,提高干细胞移植的准确率。本研究采用菲立磁-绿色荧光蛋白双标记的BMSCs,并在体外恒磁场引导下,经由外周静脉、门静脉、肝动脉移植急性肝损伤大鼠模型,以评价体外恒磁场对菲立磁-荧光蛋白双标记干细胞不同移植途径在损伤肝脏中的定植率的影响及治疗急性肝损伤的有效性,以寻找一种新的创伤小、操作方便、定植率高的移植途径。方法(1) BMSCs的分离及纯化：处死正常Wistar雌性大鼠,收集骨髓细胞,采用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法分离BMSCs,经培养传代纯化,并通过流式细胞仪检测BMSCs的特征性表面标志。(2) BMSCs的诱导分化：纯化后的BMSCs在肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)和成纤维生长因子-4(basic fibroblast factor, FGF-4)的作用下进行诱导培养28天后,体外诱导BMSCs分化为肝样细胞。(3)GFP和Feridex体外双标记BMSCs:Feridex磁化及GFP重组逆转录病毒体外双标记BMSCs,通过普鲁斯蓝染色、荧光显微镜观察、MTT(四甲基偶氮唑蓝)试验检测BMSCs双标记是否成功及标记后细胞活性。(4)动物模型的建立：选择正常Wistar雌性大鼠,腹腔注射10%CC14建立急性肝损伤大鼠模型,测定血清ALT、AST、ALB,并取肝脏组织做成病切片(HE染色),观察病理学改变。(5)不同途径移植GFP-Feridex双标记BMSCs至肝脏：GFP-Feridex体外双标记的BMSCs通过6个途径(分别为尾静脉移植、门静脉移植、肝动脉移植、尾静脉移植+体表肝区恒磁场作用、门静脉移植+体表肝区恒磁场作用、肝动脉移植+体表肝区恒磁场作用)移植至肝脏。分别于移植后第1,2,3,4周处死大鼠,测定血清ALT、AST、ALB,并取肝脏、肾脏、肺组织做成病理切片(HE染色)、荧光显微镜下观察肝脏内GFP阳性率,检测在不同移植途径下BMSCs在肝脏的定植情况及治疗效果。结果(1)采用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法分离的骨髓间充质干细胞纯度高,体外培养增殖能力活跃。(2)纯化后的BMSCs经流式细胞仪检测,高表达CD29、D44,不表达造血干细胞标志物CDllb、CD45,符合骨髓间充质干细胞的特征。(3)GFP和Feridex体外双标记BMSCs,荧光显微镜下观察可见细胞内有明亮绿色荧光的表达,普鲁士蓝染色显示Fe3+呈蓝色,表明GFP和Feridex双标记BMSCs成功。MTT检测显示,Feridex-GFP双标记的BMSCs与未标记的BMSCs在培养第14天生长无显著差异。(4)HE染色显示腹腔注射10%CCl4的急性肝损伤大鼠模型建立成功。取外周血血清检测ALB明显降低,而ALT、AST升高,均有显著差异(P<0.05)。表明急性肝损伤大鼠建模成功。(5)分别以6种不同途径移植GFP-Feridex双标记BMSCs至肝脏,分别于第1,2,3,4周随机处死6组大鼠,6种途径BMSCs移植大鼠肝脏病理结果均较前好转,组间无明显差异。取肝脏右叶做快速冰冻切片,在荧光显微镜下观察,第4周时可见6组肝脏组织中均散在分布绿色荧光阳性的细胞,表明BMSCs移植后能在肝脏顺利定植,以肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组表达较高。同时,取肾脏、肺组织做快速冰冻切片,在荧光显微镜下观察第4周肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组表达较低。(6)分别于第1、2、3、4周检测血清ALT、AST、ALB含量。结果显示,BMSCs移植后第1周起,6组均出现有差异性的转氨酶ALT、AST下降,合成ALB上升,并随着移植后时间延长,出现进一步显著性改变,表明BMSCs移植促进肝脏功能恢复。肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组在第2周即出现ALT、AST差异性下降,但在第4周,6组间ALT、AST下降无差异性。这表明经肝门静脉移植+恒磁场、肝动脉移植+恒磁场更早抑制肝脏进一步损害,促进肝功能的早期恢复。结论1、利用密度梯度离心法和贴壁细胞联合培养法在体外成功分离、纯化及培养大鼠BMSCs;2、诱导分化的BMSCs通过尾静脉、门静脉、肝动脉3种途径及其外加恒磁场作用下,移植后第4周均能定植于肝脏,且肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组BMSCs的定植率明显提高。3、在远期疗效不变的前提下,肝门静脉移植+恒磁场组、肝动脉移植+恒磁场组更早抑制肝脏进一步损害,促进肝功能的早期恢复。4、比较定植率及疗效,同时结合临床相关技术的操作难易度和可行性,我们初步认为,进行BMSCs移植治疗急性肝损伤,可以首选经门静脉+恒磁场途径、肝动脉+恒磁场途径,次选外周静脉或外周静脉+恒磁场途径。