【摘 要】
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一株高产纤维素酶的真菌菌株经形态学鉴定和ITS rDNA序列分子鉴定并被命名为长梗木霉SSL(Trichoderma longibrachiatum,SSL)。利用PCR和RT-PCR的技术从该菌株中扩增得到内切-
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一株高产纤维素酶的真菌菌株经形态学鉴定和ITS rDNA序列分子鉴定并被命名为长梗木霉SSL(Trichoderma longibrachiatum,SSL)。利用PCR和RT-PCR的技术从该菌株中扩增得到内切-1-4-β-D-葡聚糖酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ基因(egⅠ、egⅢ、egⅣ)的DNA序列和cDNA序列,其cDNA序列全长依次为:egⅠ基因1386 bp,egⅢ基因1257 bp,egⅣ基因1044 bp。这三个基因的GenBank登录号分别为:EU935217,FJ040191,FJ040192。将三基因编码的氨基酸序列分别与其它同源的氨基酸序列进行比对,发现与里氏木霉、绿色木霉的EGⅠEGⅢEGⅣ具有很高的同源性。将编码egⅠ基因和egⅢ基因的成熟肽编码序列分别插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k中,使其位于α因子信号肽序列的下游,构建获得重组表达质粒pPIC9k-egⅠ和pPIC9k-egⅢ。重组表达质粒采用电转移的方法导入到毕赤酵母(P.pastoris)GS115菌株中,经筛选获得分泌重组内切葡聚糖酶的酵母工程菌株pPIC9k-egⅠ-GS115和pPIC9k-egⅢ-GS115。重组P.pastoris菌株经甲醇诱导后,胞外重组内切葡聚糖酶Ⅰ的活力达到73 U/mL,重组内切葡聚糖酶Ⅲ的活力达到110 U/mL。在各自的SDS-PAGE中也均出现了明显加强的蛋白质条带。对pPIC9k-egⅢ-GS115转化子产酶的发酵条件进行了单因素优化,当培养基PH值为5.5,添加甲醇的浓度为1%,培养温度为30℃时,重组内切葡聚糖酶Ⅲ的活力能达到最高,与未优化相比发酵液中的酶活提高近50%。
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