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微生物发酵在中国有着悠久的历史,目前中国已成为微生物发酵大国,但并非发酵强国,我国从发酵大国转变为世界发酵强国需要革命性技术-精确工程,从而提高微生物发酵产业的竞争力,使得众多的发酵产品生产开发方面领先世界。由于微生物能够产生大量具有生物活性的次级代谢产物,但在自然环境下其产量非常低,而且其细胞内具有复杂的代谢调控网络,使得人们对于如何快速有效的提高目标产素的产量仍然没有很好的解决办法。长期以来一直采用传统的育种方法,经过长期不断的诱变和定向筛选,虽然产量得到一定提高,但对其中的高产机制仍不清楚。本论文采用精确工程的方法分析高产菌株和模式菌株的转录组和基因组水平的差异,确定与抗生素产量相关的基因,并针对关键基因进行基因工程改造提高其产量。由于阿维菌素具有高效、低毒、广谱的杀虫活性,在医药、农业和畜牧业生产中具有良好的应用价值和广阔的市场应用前景。本论文以阿维菌素产生菌阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)为例进行精确工程改造,进一步提高工业高产菌株中的阿维菌素产量。论文主要开展以下三部分的研究工作:
第一部分:产量相关关键基因的精确定位。通过转录组芯片监测生产培养基中模式菌株和工业生产菌株的转录组表达情况,结果显示在细胞生长进入静止期中期(大量产素)时高产菌株中有30个基因表现出2倍以上的上调表达。在高产菌株中阿维菌素生物合成相关基因,尤其是途径特异性调控基因aveR,具有较高的表达量。对aveR基因及其他上调表达的差异基因的上游启动子区域进行序列分析,显示有σhrdB识别和结合的保守序列,表明σhrdB对全局转录调控的作用。体外转录实验进一步验证了σhrdB对aveR启动子区域的识别和起始转录的作用。在构建的σhrdB的易错PCR突变子文库中,通过高通量筛选的方法筛选得到两株产量较原出发菌株3-115产量提高的菌株,分别提高46％和52％。通过质粒拯救的方法将突变的hrdBA56和hrdBA393从突变株的基因组上拯救出来,再次转入3-115菌株中仍然能够使得转化株的产量达到A56和A393中阿维菌素产量。对hrdBA56和hrdBA393进行序列测定,结果表明突变位点主要集中在保守的1.1区和2.4区。重组菌株A56在发酵罐上产量达到6382μg/ml,生长和产素水平稳定。以上结果表明通过精确工程方法对高产菌株的高产机制分析后确定的关键基因进行基因工程操作,能够有效地提高工业生产菌株中阿维菌素的产量,通过对关键基因hrdB的改变不仅影响了aveR的表达水平,而且在一定程度上影响了细胞内整个代谢网络的转录水平。基于以上研究表明精确工程能够用于优化复杂调控系统中的次级代谢产物,对在其他链霉菌中的活性产物产量提高有一定的指导意义。
第二部分:通过比较基因组学分析确定改造位点。为解析工业生产菌株的遗传背景及阿维菌素高产性状相关的关键基因,使用Solexa技术从头测序绘制阿维链霉菌9-39的基因组完成图,基因组共计约8,846,140bp,GC含量为70.8％。基因组共编码7,025个CDS,平均CDS长度为1,040bp。根据基因功能注释,对该菌株的次级代谢途径差异基因进行分析。对这7025个CDS编码的蛋白进行COG分类。其中有2197种与代谢相关,965种包含在遗传信息储存和处理中,835种蛋白与细胞过程和信号处理有关。951种虽然COG有收录,但功能不详。此外另有2,077种蛋白的功能在COG分类之外,其中未知功能蛋白缺失变化最多,约占14.94％,可能与次级代谢物合成和调节有关,其具体功能还有待进一步研究。在阿维菌素生物合成基因簇上存在29处差异位点,其中包括阿维菌素生物合成途径特异性基因。工业菌株的基因组测序为进一步建立以基因组信息为基础的菌株重建提供清楚的遗传背景信息,通过比较基因组学分析确定突变位点,并确定影响阿维菌素积累的突变,将有利突变重组到一个野生菌株中,从而进一步提高阿维菌素产量。
第三部分:对确定的关键基因进行精确改造。除第一部分中对hrdB基因进行遗传改造外,我们对阿维菌素生物合成基因簇中的差异基因进行功能研究,分别对染色体上的aveR,aveD,aveC,bkdF和avrH基因进行置换,对其表型进行了分析,结果表明:aveR的基因阻断突变株不能产生阿维菌素,对阿维菌素具有正调控作用；aveD的基因阻断菌株产生阿维菌素B及5-酮基阿维菌素B,仅产B组分表明aveD基因完全失活,但aveD基因的插入失活影响了下游的aveF基因,使其具有不完全活性,表明AveD与AveF之间存在相互作用；aveC基因阻断突变株不能产生阿维菌素,表明AveC并不只起影响C22-C23位脱水反应的作用,对阿维菌素聚酮长链的延伸也有影响,aveC的基因阻断影响到了阿维菌素的生物合成；bkdF基因阻断突变株在无外源添加支链脂肪酸的情况下无法合成阿维菌素,在外源添加环己羧酸时能产生多拉菌素,对环己羧酸添加的时间和浓度进行优化,从而提高多拉菌素的产量；avrH基因阻断突变株不能产生阿维菌素,可能影响了下游基因的转录。基因阻断突变株的建立为验证基因突变对于菌株生长和阿维菌素产量的影响建立基础。