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研究背景 胶质瘤是中枢神经系统中最常见的、预后最差的原发性肿瘤之一。流行病学调查显示，胶质瘤约占颅内原发性肿瘤的40％～60％，且近年来有上升的趋势[1,2]。尽管现代医学在显微外科手术治疗、放射治疗、化学治疗和生物治疗等方面取得了突飞猛进的发展，但是对胶质瘤而言，尤其是胶质母细胞瘤，目前尚缺乏有效的治疗方法。该类患者的手术预后较差，肿瘤易复发、转移以及平均生存期较短等方面主要与肿瘤细胞异常增殖活跃且呈浸润性生长等生物学特性有关[3-5]。目前，恶性肿瘤的增殖复发和侵袭转移成为患者预后差的关键，对人类的健康构成了极大的威胁。 目前恶性胶质瘤的发生机制尚不清楚，可能涉及多个基因的突变[3，5-7]。研究发现，胶质细胞的膜性结构上广泛的分布着各种类型的离子通道，并在胶质细胞的生长和代谢等多种生理活动中发挥着重要的作用[8]。深入研究提示，离子通道与胶质瘤的发生、发展密切相关，因为离子通道蛋白不仅参与胶质瘤细胞的细胞周期调控和细胞凋亡等过程，而且还参与胶质瘤细胞的增殖及迁移等生物学活动，并在其中扮演着重要的角色[7-14]。已有实验证明，氯离子通道在恶性胶质瘤细胞增殖及浸润性生长中起着重要的作用，且其特异性阻滞剂氯毒素(chlorotoxin)抗肿瘤作用已进入Ⅱ期临床试验[11]，所以探讨离子通道蛋白与胶质瘤发生、发展的关系已成为本领域研究的热点[3,6]。 电压-门控钠离子通道(voltage-gatedsodiumchannels，VGSCs)是细胞各种生理活动的最基本离子通道。目前，已知VGSCs的α亚单位有9种，即Nav1.1～Nav1.9[3，15-18]，分别由基因SCN1A～SCN5A，SCN8A～SCN11A所编码[19]。其中，由SCN5A基因编码的Nav1.5是VGSCs的9个α亚单位之一[7,18，20-22]，以前被认为是心肌的特异性离子通道，在心肌细胞动作电位产生和传导过程中起着关键作用，但研究发现该种类型Na+通道除在心肌中有极高的分布外，在中枢神经系统中亦分布广泛[16-18]。本课题组首次全序列克隆和检测了Nav1.5在人脑组织及人脑神经母细胞瘤细胞株(NB-1)的基因序列和电生理学特点，发现这种类型的Na+通道的基因序列和电生理学特点均不同于其在心肌中类型的特点，验证它是Nav1.5/SCN5A基因编码产生的一种新的幼稚型变构体，即nNav1.5[7,17-18,22](neonatalNav1.5)。在动物实验中发现，SCN5A/nNav1.5在鼠中枢神经系统各部位的表达随神经元的发育成熟或年龄的增加而逐渐下降，且在成年鼠的非脑组织中不表达[7,16-18,22]（骨骼肌组织中仅有极低的表达[23]），这也提示SCN5A/nNav1.5这种新变构体属于胚胎性基因。胚胎性基因的再表达被认为是肿瘤产生的一种机制[3,6,23]，并且国外已有研究报道，SCN5A/nNav1.5在人乳腺癌组织及其高转移性细胞系中高表达，且对其调控可显著影响乳腺癌细胞的侵袭性[23]。推测这种SCN5A/Nav1.5的新变构体是一种新型癌基因，其在恶性肿瘤增殖及侵袭性生长等方面可能扮演者重要的角色，有望成为恶性肿瘤的一个新标记物和新治疗靶点。但是，VGSCs蛋白影响恶性肿瘤细胞增殖及侵袭性等生物学特性的具体机制目前尚不清楚。目前，国内外关于VGSCs亚型SCN5A/nNav1.5在不同级别胶质瘤中的表达情况及其与胶质瘤细胞增殖、侵袭转移和凋亡的生物学关系尚未见报道。 目的 1、通过检测SCN5A/nNav1.5在人脑不同级别胶质瘤中的表达情况，探讨其与胶质瘤恶性程度的关系。 2、通过siRNA下调SCN5A/nNav1.5在胶质瘤U251细胞中的表达后，检测胶质瘤U251细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的变化，探讨SCN5A/nNav1.5在胶质瘤细胞增殖、侵袭和凋亡等细胞生物学活性中的作用。 3、观察表皮生长因子(EGF)是否通过上调SCN5A/nNav1.5在胶质瘤U251细胞中的表达水平，增加胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的生物学活性。 方法 1、首先用免疫荧光技术检测SCN5A/nNav1.5的蛋白在胶质瘤U251细胞株中的表达定位;收集2011年至2012年在中国医科大学附属第一医院神经外科手术切除并经病理诊断证实的72例人脑胶质瘤标本及12例瘤周组织作为对照组织。按2007年WHO胶质瘤分级，将胶质瘤组织标本分为低级别胶质瘤组(WHOⅠ～Ⅱ级)和高级别胶质瘤组（WHOⅢ～Ⅳ级），用Real-TimeRT-PCR技术、免疫组织化学方法和Westernbolt法分别检测SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白在不同级别胶质瘤组织及对照组织中的表达情况。 2、设计并合成SCN5A/nNav1.5靶向小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，以脂质体（Lipofectamine2000）为介质瞬时转染至胶质瘤U251细胞，应用Real-timeRT-PCR技术和Westernblot法分别检测SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白表达水平的变化，并判断siRNA的干扰效果;进一步用MTT增殖实验、划痕实验、Matrigel侵袭实验和流式细胞仪检测siRNA对U251细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。 3、应用Real-timeRT-PCR技术和Westernblot法检测EGF(100ng/L)作用胶质瘤U251细胞后SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白表达水平的变化;进一步用MTT增殖实验和Matrigel侵袭实验分别检测EGF和siRNA对细胞增殖和侵袭能力的影响。 4、实验数据采用SPSS13.0软件包(version17.0)，计量资料以均数±标准差((x)±s)表示，对数据用单因素方差分析和t检验进行统计学分析，设置P＜0.05认为具有统计学意义。 结果 1、SCN5A/nNav1.5蛋白主要在胶质瘤细胞核内表达，并且SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白在胶质瘤及对照组织中均有表达，但其在胶质瘤中的表达水平一致显著增高(P＜0.05)，在高级别胶质瘤组中的表达量亦明显高于其在低级别胶质瘤组中的表达量(P＜0.05)。SCN5A/nNav1.5的mRNA在两组胶质瘤中相对表达量分别为（1.327±0.303）和（0.875±0.219），在对照组织中为(0.509±0.131)，组间比较差异均有统计学意义（均为P＜0.05）;免疫组化结果显示SCN5A/nNav1.5在对照组、低级别胶质瘤组及高级别胶质瘤组中的细胞阳性表达率分别为（23.0±3.4）％、（52.9±3.9）％和（85.8±4.3）％;Westernblot法检测SCN5A/nNav1.5蛋白在对照组的相对表达量为（0.127±0.021），明显低于其在胶质瘤的表达水平(P＜0.05)，低级别胶质瘤组（0.241±0.033）和高级别胶质瘤组（0.643±0.059），组间比较差异也亦显著并有统计学意义(P＜0.05)。 2、Real-timeRT-PCR和Westernblot的实验结果证实成功转染siRNA至胶质瘤U251细胞中，siRNA转染U251细胞48h后，SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白表达水平明显下调，分别下降57.3％和66.0％;MTT增殖实验、划痕实验、Matrigel侵袭实验和流式细胞仪实验结果显示，siRNA下调SCN5A/nNav1.5表达后，U251细胞在体外增殖能力减弱，细胞迁移、侵袭能力降低，细胞凋亡率上升，数据结果比较均有统计学意义（均为P＜0.05）。 3、Real-timeRT-PCR和Westernblot实验结果证实EGF(100ng/L)可明显促进SCN5A/nNav1.5的mRNA和蛋白在胶质瘤U251细胞株的表达水平(均为P＜0.05);MTT增殖实验和Matrigel侵袭实验结果显示，EGF增加U251细胞的增殖和侵袭能力(P＜0.05)，siRNA可显著降低EGF对U251细胞增殖和侵袭的促进作用。 结论 1、SCN5A/nNav1.5在人脑胶质瘤中表达上调并与胶质瘤的恶性程度呈正相关，其有可能是胶质瘤恶性增殖的一个调控因子。 2、SCN5A/nNav1.5可促进胶质瘤U251细胞生物学活性，在胶质瘤的发生、发展过程中起着重要作用，有望成为胶质瘤的一个新标记物和治疗的新靶点。 3、EGF上调胶质瘤U251细胞中SCN5A/nNav1.5的表达，并且SCN5A/nNav1.5参与EGF促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭的过程。