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研究背景：急性白血病(AL)为一组造血系统恶性疾病,是我国的十大恶性肿瘤之一,是青少年和35岁以下成年人发病率最高的恶性肿瘤。目前对AL发生的分子机制尚不明确。尽管随着化疗方案的改善,AML完全缓解(CR)率可达70%左右,但大部分患者会出现复发,一旦复发,预后差。难治复发是目前导致AML治疗失败的最根本原因,因此深入研究急性白血病发生和发展(难治复发)的分子机制是非常重要的。研究表明AL的发生和发展是多种相关基因表达失常或/和抑癌基因失活所致,正常基因突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达、耐药基因的表达增加、凋亡基因受抑、基因本身的多效性以及多个基因的协同作用和机体免疫因素,决定最终白血病发生和发展。近几年发现脑和急性白血病胞浆(BAALC)基因与AL的发生、发展关系密切,是正常核型AML(NC-AML)患者最有意义的预后指标和潜在的治疗靶点之一。有研究发现BAALC基因在部分AML、ALL和CML急变期(CML-BP)患者高表达,而在CML慢性期(CML-CP)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)不表达,因此推测BAALC基因可能与AML和ALL发生密切相关。有研究报道正常核型AML患者中70%存在BAALC基因显著高表达,且BAALC表达量与NC-AML预后关系密切,BALLC表达量越高,AML患者预后越差,BAALC高表达的AML患者其无病生存期(DFS)和总生存期(OS)明显缩短。多变量分析也表明,BALLC是独立于FLT-ITD、MLL-TD外的,在NC-AML中最具意义的预后因素之一,与低表达病例相比,耐药率、累计复发率明显增高,死亡的危险度高2.7倍。我们前期工作通过实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测AML患者BAALC基因的表达,也发现大部分初治AML可出现BAALC的高表达,而正常对照组未检出BAALC的表达,正常核型初治AML高表达BAALC者化疗CR率显著低于低表达者,OS更短,预后更差。由于BAALC与AL的研究尚处于起步阶段,目前关于BAALC基因和蛋白的功能、BAALC在AL发病和难治复发中作用的分子机制、上下游转录调控网络及其信号传导通路尚未清楚,有关BAALC基因在AL细胞中稳定过表达对AL细胞生物学行为的影响尚未见相关文献报道。研究目的：通过基因工程技术在体外构建pMSCV-BAALC表达载体,并通过细胞转染技术将该表达载体导入人白血病细胞株中,建立稳定表达的BAALC基因的人白血病细胞株,并进一步研究BAALC基因过表达对人白血病细胞株生物学行为的影响。研究方法：1.从KASUMI-1细胞株中提取mRNA,应用RT-PCR技术扩增BAALC1-6-8获得目的基因片段,选用pMDTM 18-T Vector做TA克隆。分别双酶切TA克隆获得的阳性质粒和pcDNATM3.1/myc-His A质粒,琼脂糖电泳纯化回收前者的小片段和后者的大片段,应用T4连接酶连接后转化至E.coli DH5α中。PCR扩增BAALC-his基因序列,双酶切PCR产物和pMSCV载体,T4连接酶连接后转化至E.coli DH5α中,挑选阳性克隆,构建pMSCV-BAALC表达载体,应用PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定。2.重组载体以脂质体转染的方法导入不表达BAALC基因的人白血病细胞株(HL60/ADM、Molt-4和K562)中,Puro抗性筛选获得阳性克隆细胞株,从而获得稳定过表达BAALC基因的白血病细胞株。提取总RNA和总蛋白,分别行RT-PCR和Western blot验证转染后BAALC基因在三种白血病细胞株中表达情况。3.扩大培养稳定表达BAALC基因的HL60/ADM细胞株,通过细胞形态学、MTT及流式细胞术等方法检测BAALC基因对HL60/ADM细胞株的增殖、凋亡的影响。4.统计学分析：用SPSS 13.0软件包处理,P≤0.05表示差异有显著性意义。研究结果：1、重组质粒pMSCV-BAALC后,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及BAALC-A/S引物扩增PCR产物,双酶切产物在5.9kb和535bp处各见一清晰的条带,其中535bp处的条带与PCR扩增BAALC片段大小相当,初步证实BAALC基因已连接到pMSCV表达载体上。根据pMSCV表达载体上下游引物序列,正向(5’→3’)测序结果经核对后,证实基因插入准确无误。2、细胞转染48h后进行荧光显微镜观察GFP表达情况,可见部分细胞呈GFP阳性,转染48h收集细胞,PBS洗涤后以流式细胞术(FACS)检测GFP表达情况,并计算最佳转染效率。3、RT-PCR检测HL60/ADM、MOLT-4和K562细胞株及其各自转染pMSCV空载体和pMSCV-BAALC重组载体的稳定细胞株的BAALC基因表达情况。结果显示,三种细胞株均能表达稳定的GAPDH基因,根据pMSCV表达载体的特点,我们设计了针对位于pMSCV的5’LTR和3’LTR序列之间的PGK基因片段的引物,检测pMSCV的5’LTR和3’LTR序列之间基因表达情况,结果可见,HL60/ADM、MOLT-4和K562细胞株没有PGK基因序列的表达,但转染pMSCV空载体和pMSCV-BAALC重组载体的细胞株均有很强的PGK序列表达,BAALC基因在HL60/ADM、MOLT-4和K562细胞株和转染pMSCV空载体组均没有表达,而在转染pMSCV-BAALC重组载体组表达较强。同时选取KASUMI-1细胞株为阳性对照,可见转染pMSCV-BAALC重组载体的细胞株与KASUMI-1细胞株扩增出来的BAALC基因片段大小相当。4、Western blot检测转染BAALC基因前后细胞表达BAALC蛋白情况。结果显示在导入pMSCV-BAALC重组载体后,BAALC蛋白均能在HL60/ADM、MOLT-4和K562细胞株中稳定表达,提示重组载体能充分发挥过表达作用,表明已成功建立了稳定表达BAALC基因的三种人白血病细胞株。5、细胞形态学结果提示,HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV及HL60/ADM+ pMSCV-BAALC细胞均以异常早幼粒细胞为主,细胞核质比较大,胞浆染蓝色,染色质呈颗粒状,但HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞多核细胞比例增高(双核、四核)。提示HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞较其他两种细胞增殖快,恶性程度高。6、MTT结果显HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV及HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞的增殖率存在统计学差异(F=254.832,P=0.000),结合多重比较结果显示,HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞株的增殖率(均数0.563)显著高于HL60/ADM细胞株(均数0.479)和HL60/ADM+pMSCV细胞株(均数0.450),(P分别为0.044和0.009)；而HL60/ADM细胞株和HL60/ADM+pMSCV细胞株的增殖率比较差异无统计学意义(P=0.891)。7、Annexin V/PI检测凋亡细胞比例的结果显示：HL60/ADM、HL60/ADM+ pMSCV及HL60/ADM+pMSCV-BAALC3种细胞间的凋亡细胞比例存在统计学差异(F=124.437,P=0.000),结合多重比较结果显示HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞株的凋亡比率(均数18.618)显著低于HL60/ADM(均数44.205)和HL60/ADM+pMSCV细胞株(均数43.952)(P均为0.017)；而HL60/ADM+pMSCV细胞株的凋亡比率与HL60/ADM细胞株比较差异无统计学差异(P=1.000)。8、As2O3浓度为1μg/ml分别作用于HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV及HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞株24h后,发现HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞株的(G0+G1)期、G2期均较HL60/ADM和HL60/ADM+pMSCV细胞株明显延长,而HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞株的S期较HL60/ADM、HL60/ADM+pMSCV细胞株缩短,显示HL60/ADM+pMSCV-BAALC细胞株的增殖较HL60/ADM和HL60/ADM+pMSCV细胞株快。结论：成功构建BAALC基因的表达载体,分别转染人HL60/ADM、MOLT-4和K562细胞株筛选得到稳定过表达该基因细胞系；BAALC基因能促进HL60/ADM细胞株的增殖、抑制凋亡及提高HL60/ADM细胞株拮抗As2O3诱导凋亡的能力。