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粘虫Mythimna separata隶属于昆虫纲（Insecta）鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）,是一种世界性的农业迁飞害虫。种群密度影响粘虫迁飞能源物质甘油三酯的合成,群居型成虫的甘油三酯含量高于散居型,群居型粘虫更适合远距离迁飞,危害范围更广。已有文献报道,视黄醛脱氢酶（Retinal dehydrogenase,RALDH）调控小鼠Mus musculus体内甘油三酯的合成。RALDH基因是否响应粘虫种群密度调控甘油三酯合成的研究少有报道。因此,依据候选基因法,探究RALDH基因对粘虫幼虫甘油三酯合成的影响,以期为阐明粘虫迁飞机制提供基础数据,同时为粘虫的防治工作提供理论基础。本研究运用GPO-PAP酶法,测定了两种生活型（散居型:1头/瓶;群居型10头/瓶）4龄、5龄和6龄粘虫幼虫甘油三酯含量;运用RACE和RT-qPCR技术,克隆获得了粘虫RALDH基因cDNA全长序列并建立了RALDH表达模式;进一步应用植物介导昆虫RNAi技术,探讨了RALDH基因对粘虫幼虫甘油三酯合成的影响。1.基于转录组数据,分析甘油三酯合成通路。本研究利用Illumina Hi SeqTM2000高通量测序平台对粘虫散居型（MS）与群居型（MG）5龄幼虫进行转录组测序并建立数据库。结果显示,每个样品的转录组数据量约为8.76Gb,所有样品的碱基正确率（Q20）均高于98%,GC含量在51.29%-53.04%之间。使用Trinity软件组装clean reads,使用Trinity软件组装clean reads共获得58 094条unigenes,与Nr、Swissport、KOG和KEGG数据库中比对,共注释30 184（51.96%）条unigenes。通过对转录组数据分析发现,在群居型的甘油三酯代谢通路上RALDH基因上调表达,推测该基因响应种群密度影响甘油三酯的合成。2.两种生活型粘虫幼虫甘油三酯含量测定。利用甘油三酯（TG）GPO-PAP酶法,测定两种生活型4龄、5龄和6龄粘虫幼虫甘油三酯含量。结果显示,群居型粘虫幼虫甘油三酯含量均高于散居型,且甘油三酯含量随幼虫龄期的增长而增加。散居型4龄幼虫甘油三酯含量（0.774±0.01 mmol/L）与群居型（0.8165±0.03 mmol/L）无显著性差异（P>0.05）;群居型5龄（1.508±0.05 mmol/L）和6龄（2.015±0.03mmol/L）幼虫甘油三酯含量均显著高于散居型5龄（1.232±0.01mmol/L）和6龄（1.596±0.04 mmol/L）（P<0.05）。3.RALDH基因的克隆与生物信息学分析。根据RALDH unigene序列,设计克隆RALDH全长cDNA序列所需引物;利用RACE和RT-qPCR技术,扩增RALDH基因cDNA 5’端与3’端序列,通过Conting Express?软件对所获的5’端、3’端及unigene序列进行拼接,获得粘虫RALDH基因全长cDNA序列。结果显示,RALDH基因全长cDNA序列为1 901 bp,开放阅读框（ORF）长度为1 461bp,编码一条含486个氨基酸残基组成的肽链。起始密码子ATG位于第99-101位核苷酸,终止密码子TAA位于第1 557-1 559位核苷酸。5’非翻译区（5’-UTR）长度为98 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长度为342 bp。编码的蛋白质分子量为52.382KDa,理论等电点为5.98。对该蛋白质的结构域鉴定发现,该蛋白属于醛脱氢酶超家族（ALDH super family）。同源序列比对显示,RALDH基因与棉铃虫Helicoverpa armigera RALDH的相似度达到83.74%,与斜纹夜蛾Spodoptera litura RALDH基因相似度有82.72%。表明确定克隆获得的序列为粘虫RALDH基因全长cDNA序列。基于RALDH蛋白氨基酸序列,利用MEGA7.0软件采用邻接法（Neighbor-joining）对粘虫和其他12种昆虫RALDH蛋白氨基酸序列进行比对构建系统发育树。结果显示粘虫与斜纹夜蛾S.litura聚在同一分支且bootstrap值为87,表明这两个种遗传距离最近。4.粘虫幼虫RALDH基因的表达模式。（1）幼虫各组织中RALDH基因的表达模式。应用RT-qPCR技术测定RALDH基因在5龄幼虫头部、表皮、前肠、中肠、后肠、脂肪体和马氏管中mRNA的表达情况。结果显示,粘虫RALDH基因在不同组织中均有表达,脂肪体中RALDH基因mRNA水平极显著高于其他组织（P<0.01）,马氏管、前肠和中肠次之,头部表达量最低。（2）两种生活型粘虫幼虫RALDH基因的表达模式。应用RT-qPCR技术测定两种生活型4龄、5龄和6龄粘虫幼虫RALDH基因mRNA的表达水平。结果显示,群居型RALDH基因mRNA表达量高于散居型,mRNA水平随幼虫龄期的增长而增加。两种生活型4龄幼虫RALDH基因mRNA表达水平无显著性差异（P>0.05）;群居型5龄和6龄幼虫RALDH基因的表达量均显著高于散居型（P<0.05）。5.RALDH基因对粘虫甘油三酯合成的影响（1）玉米介导粘虫RNAi体系的建立。根据RALDH基因序列确定其干扰靶标片段,设计5’端引入Bam HI（CGGGGATCC）和Kpn I（CGGGGTACC）酶切位点的上下游特异性引物,利用RCR技术扩增干扰片段。用p TRV2作为表达载体,将400 bp RALDH基因干扰片段与p TRV2载体重组形成p TRV2-RALDH质粒。通过农杆菌GV3101介导,将p TRV2-RALDH和p TRV2-GFP重组质粒（实验室提供）菌液分别与p TRV1质粒菌液按1:1比例混合,通过真空渗入法分别转化玉米胚芽,使玉米表达RALDH-ds RNA和GFP-ds RNA。测定饲喂含有RALDH-ds RNA和GFP-ds RNA的玉米植株粘虫的RALDH基因mRNA的表达量及干扰后粘虫幼虫甘油三酯含量。结果显示,饲喂空白组与表达GFP-ds RNA阴性对照组幼虫相比,RALDH基因mRNA的表达量无显著性差异（P>0.05）;饲喂RALDH-ds RNA的实验组4龄、5龄和6龄幼虫RALDH基因mRNA的表达量均显著降低（P<0.05）,表明玉米介导粘虫RALDH RNAi产生沉默效果。（2）粘虫甘油三酯含量的测定。利用甘油三酯GPO-PAP酶法测定空白组、阴性对照组（GFP-ds RNA）和实验组（RALDH-ds RNA）的甘油三酯含量。结果表明,空白对照组甘油三酯含量与阴性对照组相比差异无显著性,实验组4龄幼虫甘油三酯含量与对照组相比无显著差异（P>0.05）,实验组5龄和6龄幼虫甘油三酯含量显著低于对照组（P<0.05）。表明饲喂粘虫含有RALDH-ds RNA的玉米植株,有效降低了粘虫体内甘油三酯含量。由此,我们推测RALDH基因对粘虫甘油三酯合成有调控作用。综上所述,本研究利用RACE、RT-qPCR技术获得了粘虫RALDH基因cDNA序列及时空表达情况,通过寄主植物-玉米介导粘虫RNAi技术有效抑制粘虫幼虫RALDH基因的表达,其结果影响了粘虫幼虫体内甘油三酯含量,表明RALDH基因参与调控粘虫甘油三酯合成。